中华医学杂志
中華醫學雜誌
중화의학잡지
National Medical Journal of China
2006年
8期
544-548
,共5页
李娅%陈楠%俞海瑾%董晓蓓%黄秋花
李婭%陳楠%俞海瑾%董曉蓓%黃鞦花
리아%진남%유해근%동효배%황추화
肾小管%上皮细胞%骨形态发生蛋白质类%转染
腎小管%上皮細胞%骨形態髮生蛋白質類%轉染
신소관%상피세포%골형태발생단백질류%전염
目的构建骨形成蛋白-7(BMP-7)全长基因表达质粒,观察BMP-7过表达对转化生长因子(TGF)-β诱导的人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌(ECM)的作用.方法将BMP-7全长cDNA连接进入真核细胞表达质粒pcDNA3.1中,以脂质体Superfect介导的方法将重组表达质粒pcDNA3.1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞,挑选阳性克隆,以获得稳定转染的人肾小管上皮细胞株.采用Western 印迹方法检测BMP-7在肾小管上皮细胞培养上清液中的表达.给予TGF-β(5 ng/ml)进行处理,应用RT-PCR和ELISA的方法,观察BMP-7过表达对纤维粘连蛋白(FN)、胶原Ⅰ、Ⅲ(Col Ⅰ、Ⅲ)等细胞外基质mRNA和蛋白质表达的作用.结果 EcoR I限制性酶切鉴定以及DNA双向测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7全长基因表达质粒.Western 印迹方法检测稳定转染人肾小管上皮细胞蛋白表达量明显高于空载体转染组(P<0.05).TGF-β处理24、48、72 h后, 5 ng/ml TGF-β处理组、空白质粒转染(pcDNA3.1)+5 ng/ml TGF-β组Col Ⅰ、Ⅲ、FN mRNA的表达量明显高于正常对照组,空白质粒转染组(pcDNA3.1)[ColⅠ (A值): 0.897±0.100、1.054±0.090 vs 0.286±0.010、0.319±0.080;Col Ⅲ (A值): 1.114±0.040、0.961±0.090 vs 0.354±0.020、0.403±0.040; FN (A值): 1.257±0.090、1.188±0.060 vs 0.413±0.020、0.454±0.060,均P<0.05];Col I、FN mRNA表达量pcDNA3.1-BMP-7转染组+5 ng/ml TGF-β组明显低于TGF-β处理组(0.591±0.007、0.687±0.020,P<0.05),ColⅢmRNA表达有降低趋势(0.809±0.090),但差异无统计学意义.细胞培养上清液FN含量5 ng/ml TGF-β处理组、空白质粒转染(pcDNA3.1)+5 ng/ml TGF-β组明显高于正常对照组(P<0.05),而 pcDNA3.1-BMP-7转染组+5 ng/ml TGF-β组表达明显低于TGF-β处理组(P<0.05).结论 BMP-7过表达可以显著减少TGF-β所致的人肾小管上皮细胞FN、 Col Ⅰ、Ⅲ mRNA和细胞培养上清液中的FN的表达.表明BMP-7减少小管间质炎症反应和纤维化的发生,改善肾功能的作用,部分是通过抑制肾小管上皮细胞分泌细胞外基质实现的.
目的構建骨形成蛋白-7(BMP-7)全長基因錶達質粒,觀察BMP-7過錶達對轉化生長因子(TGF)-β誘導的人腎小管上皮細胞細胞外基質分泌(ECM)的作用.方法將BMP-7全長cDNA連接進入真覈細胞錶達質粒pcDNA3.1中,以脂質體Superfect介導的方法將重組錶達質粒pcDNA3.1-BMP-7轉染入人腎小管上皮細胞,挑選暘性剋隆,以穫得穩定轉染的人腎小管上皮細胞株.採用Western 印跡方法檢測BMP-7在腎小管上皮細胞培養上清液中的錶達.給予TGF-β(5 ng/ml)進行處理,應用RT-PCR和ELISA的方法,觀察BMP-7過錶達對纖維粘連蛋白(FN)、膠原Ⅰ、Ⅲ(Col Ⅰ、Ⅲ)等細胞外基質mRNA和蛋白質錶達的作用.結果 EcoR I限製性酶切鑒定以及DNA雙嚮測序結果均說明所構建的重組質粒為BMP-7全長基因錶達質粒.Western 印跡方法檢測穩定轉染人腎小管上皮細胞蛋白錶達量明顯高于空載體轉染組(P<0.05).TGF-β處理24、48、72 h後, 5 ng/ml TGF-β處理組、空白質粒轉染(pcDNA3.1)+5 ng/ml TGF-β組Col Ⅰ、Ⅲ、FN mRNA的錶達量明顯高于正常對照組,空白質粒轉染組(pcDNA3.1)[ColⅠ (A值): 0.897±0.100、1.054±0.090 vs 0.286±0.010、0.319±0.080;Col Ⅲ (A值): 1.114±0.040、0.961±0.090 vs 0.354±0.020、0.403±0.040; FN (A值): 1.257±0.090、1.188±0.060 vs 0.413±0.020、0.454±0.060,均P<0.05];Col I、FN mRNA錶達量pcDNA3.1-BMP-7轉染組+5 ng/ml TGF-β組明顯低于TGF-β處理組(0.591±0.007、0.687±0.020,P<0.05),ColⅢmRNA錶達有降低趨勢(0.809±0.090),但差異無統計學意義.細胞培養上清液FN含量5 ng/ml TGF-β處理組、空白質粒轉染(pcDNA3.1)+5 ng/ml TGF-β組明顯高于正常對照組(P<0.05),而 pcDNA3.1-BMP-7轉染組+5 ng/ml TGF-β組錶達明顯低于TGF-β處理組(P<0.05).結論 BMP-7過錶達可以顯著減少TGF-β所緻的人腎小管上皮細胞FN、 Col Ⅰ、Ⅲ mRNA和細胞培養上清液中的FN的錶達.錶明BMP-7減少小管間質炎癥反應和纖維化的髮生,改善腎功能的作用,部分是通過抑製腎小管上皮細胞分泌細胞外基質實現的.
목적구건골형성단백-7(BMP-7)전장기인표체질립,관찰BMP-7과표체대전화생장인자(TGF)-β유도적인신소관상피세포세포외기질분비(ECM)적작용.방법장BMP-7전장cDNA련접진입진핵세포표체질립pcDNA3.1중,이지질체Superfect개도적방법장중조표체질립pcDNA3.1-BMP-7전염입인신소관상피세포,도선양성극륭,이획득은정전염적인신소관상피세포주.채용Western 인적방법검측BMP-7재신소관상피세포배양상청액중적표체.급여TGF-β(5 ng/ml)진행처리,응용RT-PCR화ELISA적방법,관찰BMP-7과표체대섬유점련단백(FN)、효원Ⅰ、Ⅲ(Col Ⅰ、Ⅲ)등세포외기질mRNA화단백질표체적작용.결과 EcoR I한제성매절감정이급DNA쌍향측서결과균설명소구건적중조질립위BMP-7전장기인표체질립.Western 인적방법검측은정전염인신소관상피세포단백표체량명현고우공재체전염조(P<0.05).TGF-β처리24、48、72 h후, 5 ng/ml TGF-β처리조、공백질립전염(pcDNA3.1)+5 ng/ml TGF-β조Col Ⅰ、Ⅲ、FN mRNA적표체량명현고우정상대조조,공백질립전염조(pcDNA3.1)[ColⅠ (A치): 0.897±0.100、1.054±0.090 vs 0.286±0.010、0.319±0.080;Col Ⅲ (A치): 1.114±0.040、0.961±0.090 vs 0.354±0.020、0.403±0.040; FN (A치): 1.257±0.090、1.188±0.060 vs 0.413±0.020、0.454±0.060,균P<0.05];Col I、FN mRNA표체량pcDNA3.1-BMP-7전염조+5 ng/ml TGF-β조명현저우TGF-β처리조(0.591±0.007、0.687±0.020,P<0.05),ColⅢmRNA표체유강저추세(0.809±0.090),단차이무통계학의의.세포배양상청액FN함량5 ng/ml TGF-β처리조、공백질립전염(pcDNA3.1)+5 ng/ml TGF-β조명현고우정상대조조(P<0.05),이 pcDNA3.1-BMP-7전염조+5 ng/ml TGF-β조표체명현저우TGF-β처리조(P<0.05).결론 BMP-7과표체가이현저감소TGF-β소치적인신소관상피세포FN、 Col Ⅰ、Ⅲ mRNA화세포배양상청액중적FN적표체.표명BMP-7감소소관간질염증반응화섬유화적발생,개선신공능적작용,부분시통과억제신소관상피세포분비세포외기질실현적.
