中华医学遗传学杂志
中華醫學遺傳學雜誌
중화의학유전학잡지
CHINESE JOURNAL OF MEDICAL GENETICS
2002年
1期
68-71
,共4页
莫秋华%徐湘民%钟雄霖%刘忠英
莫鞦華%徐湘民%鐘雄霖%劉忠英
막추화%서상민%종웅림%류충영
大引物%聚合酶链反应%定点诱变%β珠蛋白基因
大引物%聚閤酶鏈反應%定點誘變%β珠蛋白基因
대인물%취합매련반응%정점유변%β주단백기인
目的建立一种改进的、简便易行的大引物PCR定点诱变技术.方法在两轮PCR中设计了两种不同的质粒DNA模板,两者分别缺少正向或反向外侧引物可结合的互补序列;当两种模板和两条外侧引物同时存在于一个反应管时,可以完全避免对野生型目的基因全长的扩增.第1轮PCR由正向外侧引物和突变引物合成大引物,这一产物无需凝胶纯化而直接用于第2轮PCR.第2轮PCR的第1阶段由大引物延伸合成全长突变终产物,两条外侧引物则在第2阶段指数扩增,所有终产物均含所需致突变位点.结果用此方法对中国人β地中海贫血15种稀少突变类型进行定点诱变,并将诱变得到的全长人β珠蛋白基因克隆到pGEM○ R-T载体后全长测序,所有克隆均鉴定为所需突变型.结论这种改进的大引物PCR定点诱变技术省时、省工,诱变的成功率可00%,适于实验室常规应用.
目的建立一種改進的、簡便易行的大引物PCR定點誘變技術.方法在兩輪PCR中設計瞭兩種不同的質粒DNA模闆,兩者分彆缺少正嚮或反嚮外側引物可結閤的互補序列;噹兩種模闆和兩條外側引物同時存在于一箇反應管時,可以完全避免對野生型目的基因全長的擴增.第1輪PCR由正嚮外側引物和突變引物閤成大引物,這一產物無需凝膠純化而直接用于第2輪PCR.第2輪PCR的第1階段由大引物延伸閤成全長突變終產物,兩條外側引物則在第2階段指數擴增,所有終產物均含所需緻突變位點.結果用此方法對中國人β地中海貧血15種稀少突變類型進行定點誘變,併將誘變得到的全長人β珠蛋白基因剋隆到pGEM○ R-T載體後全長測序,所有剋隆均鑒定為所需突變型.結論這種改進的大引物PCR定點誘變技術省時、省工,誘變的成功率可00%,適于實驗室常規應用.
목적건립일충개진적、간편역행적대인물PCR정점유변기술.방법재량륜PCR중설계료량충불동적질립DNA모판,량자분별결소정향혹반향외측인물가결합적호보서렬;당량충모판화량조외측인물동시존재우일개반응관시,가이완전피면대야생형목적기인전장적확증.제1륜PCR유정향외측인물화돌변인물합성대인물,저일산물무수응효순화이직접용우제2륜PCR.제2륜PCR적제1계단유대인물연신합성전장돌변종산물,량조외측인물칙재제2계단지수확증,소유종산물균함소수치돌변위점.결과용차방법대중국인β지중해빈혈15충희소돌변류형진행정점유변,병장유변득도적전장인β주단백기인극륭도pGEM○ R-T재체후전장측서,소유극륭균감정위소수돌변형.결론저충개진적대인물PCR정점유변기술성시、성공,유변적성공솔가00%,괄우실험실상규응용.
