中国实验诊断学
中國實驗診斷學
중국실험진단학
CHINESE JOURNAL OF LABORATORY DIAGNOSIS
2009年
6期
713-715
,共3页
程祖建%杨滨%江凌%陈静%欧启水
程祖建%楊濱%江凌%陳靜%歐啟水
정조건%양빈%강릉%진정%구계수
DNA%线粒体%RT-ARMS-qPCR系统%耳聋
DNA%線粒體%RT-ARMS-qPCR繫統%耳聾
DNA%선립체%RT-ARMS-qPCR계통%이롱
目的 建立RT-ARMS-qPCR(real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR)系统定量测定含线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA) A1555G位点突变的片段的拷贝数,为阐明线粒体耳聋临床表型多样性的分子生物学基础奠定基础.方法 根据ARMS的基本原理设计引物,在引物3'端插入错配碱基AC建立RT-ARMS-qPCR系统,优化定量PCR体系,并进行方法学评价.经PCR分别扩增相应突变型和野生型的片段,将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;同时对含突变型和/或野生型mtDNA 1555位点的片段的拷贝数进行定量检测.结果 RT-ARMS-qPCR系统用于检测含mtDNA 1555位点的片段,线性检测范围为102-108拷贝数/μl,检测灵敏度为1×102拷贝数/μl,其批内变异系数(CV)为1.34%,批间CV为1.96%,重复性好;突变型和野生型引物分别只扩增相应片段,特异性好.结论 RT-ARMS-qPCR系统适合于定量检测含mtDNA A1555G点突变的线粒体DNA片段,结果稳定、准确,有助于阐明线粒体耳聋严重程度的分子基础.
目的 建立RT-ARMS-qPCR(real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR)繫統定量測定含線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA) A1555G位點突變的片段的拷貝數,為闡明線粒體耳聾臨床錶型多樣性的分子生物學基礎奠定基礎.方法 根據ARMS的基本原理設計引物,在引物3'耑插入錯配堿基AC建立RT-ARMS-qPCR繫統,優化定量PCR體繫,併進行方法學評價.經PCR分彆擴增相應突變型和野生型的片段,將其剋隆到pGEM-T Easy載體上,構建質粒標準品;同時對含突變型和/或野生型mtDNA 1555位點的片段的拷貝數進行定量檢測.結果 RT-ARMS-qPCR繫統用于檢測含mtDNA 1555位點的片段,線性檢測範圍為102-108拷貝數/μl,檢測靈敏度為1×102拷貝數/μl,其批內變異繫數(CV)為1.34%,批間CV為1.96%,重複性好;突變型和野生型引物分彆隻擴增相應片段,特異性好.結論 RT-ARMS-qPCR繫統適閤于定量檢測含mtDNA A1555G點突變的線粒體DNA片段,結果穩定、準確,有助于闡明線粒體耳聾嚴重程度的分子基礎.
목적 건립RT-ARMS-qPCR(real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR)계통정량측정함선립체DNA(mitochondrial DNA,mtDNA) A1555G위점돌변적편단적고패수,위천명선립체이롱림상표형다양성적분자생물학기출전정기출.방법 근거ARMS적기본원리설계인물,재인물3'단삽입착배감기AC건립RT-ARMS-qPCR계통,우화정량PCR체계,병진행방법학평개.경PCR분별확증상응돌변형화야생형적편단,장기극륭도pGEM-T Easy재체상,구건질립표준품;동시대함돌변형화/혹야생형mtDNA 1555위점적편단적고패수진행정량검측.결과 RT-ARMS-qPCR계통용우검측함mtDNA 1555위점적편단,선성검측범위위102-108고패수/μl,검측령민도위1×102고패수/μl,기비내변이계수(CV)위1.34%,비간CV위1.96%,중복성호;돌변형화야생형인물분별지확증상응편단,특이성호.결론 RT-ARMS-qPCR계통괄합우정량검측함mtDNA A1555G점돌변적선립체DNA편단,결과은정、준학,유조우천명선립체이롱엄중정도적분자기출.
