安徽医科大学学报
安徽醫科大學學報
안휘의과대학학보
ACTA UNIVERSITY MEDICINALIS ANHUI
2007年
5期
477-481
,共5页
蛋白质酪氨酸磷酸酶/拮抗剂和抑制剂%COS细胞%基因表达%遗传载体
蛋白質酪氨痠燐痠酶/拮抗劑和抑製劑%COS細胞%基因錶達%遺傳載體
단백질락안산린산매/길항제화억제제%COS세포%기인표체%유전재체
目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B并在猴肾成纤维细胞COS-7中稳定表达,分离纯化表达的重组融合蛋白,进行酶活性测定及抑制剂的初步实验.方法 应用RT-PCR从2型糖尿病患者的外周血总RNA中扩增出PTP1B cDNA全长序列,并在基因上下游分别引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ两个酶切位点,酶切后定向导入pcDNA3.1/Hismyc-B多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,转染COS-7细胞,G-418筛选2周后取细胞裂解上清液经Ni2+亲和层析柱纯化后,测定了其酶活性及小分子抑制剂钒酸钠的IC50.结果 从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1 301 bpPTB1B cDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明hPTP1B已克隆到poDNA3.1/Hismyc-B中.RT-PCR和免疫印迹表明转染成功.酶活性实验初步显示rhPTP1B的活性随酶浓度增加而增加,随PTP1B的特异性抑制剂钒酸钠的浓度增加而减少.结论 获得具有酶活性的融合蛋白rhPTP1B,为进一步筛选其特异性抑制剂奠定基础.
目的 構建人蛋白酪氨痠燐痠酶1B(PTP1B)真覈錶達載體pcDNA3.1-hPTP1B併在猴腎成纖維細胞COS-7中穩定錶達,分離純化錶達的重組融閤蛋白,進行酶活性測定及抑製劑的初步實驗.方法 應用RT-PCR從2型糖尿病患者的外週血總RNA中擴增齣PTP1B cDNA全長序列,併在基因上下遊分彆引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ兩箇酶切位點,酶切後定嚮導入pcDNA3.1/Hismyc-B多剋隆位點,構建真覈錶達載體pcDNA3.1-hPTP1B,轉染COS-7細胞,G-418篩選2週後取細胞裂解上清液經Ni2+親和層析柱純化後,測定瞭其酶活性及小分子抑製劑釩痠鈉的IC50.結果 從2型糖尿病患者外週血中擴增得到1 301 bpPTB1B cDNA全長序列,經雙酶切鑒定及測序分析,錶明hPTP1B已剋隆到poDNA3.1/Hismyc-B中.RT-PCR和免疫印跡錶明轉染成功.酶活性實驗初步顯示rhPTP1B的活性隨酶濃度增加而增加,隨PTP1B的特異性抑製劑釩痠鈉的濃度增加而減少.結論 穫得具有酶活性的融閤蛋白rhPTP1B,為進一步篩選其特異性抑製劑奠定基礎.
목적 구건인단백락안산린산매1B(PTP1B)진핵표체재체pcDNA3.1-hPTP1B병재후신성섬유세포COS-7중은정표체,분리순화표체적중조융합단백,진행매활성측정급억제제적초보실험.방법 응용RT-PCR종2형당뇨병환자적외주혈총RNA중확증출PTP1B cDNA전장서렬,병재기인상하유분별인입BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ량개매절위점,매절후정향도입pcDNA3.1/Hismyc-B다극륭위점,구건진핵표체재체pcDNA3.1-hPTP1B,전염COS-7세포,G-418사선2주후취세포렬해상청액경Ni2+친화층석주순화후,측정료기매활성급소분자억제제범산납적IC50.결과 종2형당뇨병환자외주혈중확증득도1 301 bpPTB1B cDNA전장서렬,경쌍매절감정급측서분석,표명hPTP1B이극륭도poDNA3.1/Hismyc-B중.RT-PCR화면역인적표명전염성공.매활성실험초보현시rhPTP1B적활성수매농도증가이증가,수PTP1B적특이성억제제범산납적농도증가이감소.결론 획득구유매활성적융합단백rhPTP1B,위진일보사선기특이성억제제전정기출.
