CAJ | 학술논문

人mtDNA比核DNA更易受到自由基的氧化损伤,这些损伤可以被线粒体内的DNA修复机制所修复,损伤与修复是决定突变是否产生的两个重要因素.为了确定氧化损伤与损伤后修复对mtDNA突变的具体影响,采用四氧嘧啶处理LO2细胞,这种试剂进入细胞后,经氧化还原反应生成的自由基与线粒体自身代谢产生的自由基类似,然后观察自由基对细胞mtDNA的氧化损伤与损伤后DNA修复的动力学变化.由于线粒体的正常功能为修复机制所必需,采用MTT细胞活力实验检测不同浓度四氧嘧啶处理下线粒体酶活力,发现9 mmol/L四氧嘧啶培养细胞1h后,线粒体琥珀酸脱氢酶功能在撤去药物后0,2,8和24 h时间点均无明显变化.提取各组细胞的mtDNA,用EndoⅢ和Fgp两种酶切除受氧化损伤的核苷酸,然后用碱性琼脂糖凝胶电泳分离大小不等的mtDNA,进行DNA印迹实验,地高辛-抗体-碱性磷酸酶系统显色,检测完整与断裂的mtDNA量,利用Poisson公式(s=-lnP0/P,P0为未断裂链光密度值,P为所有链光密度值总和)计算一个mtDNA分子的平均损伤频率,结果显示,9 mmol/L四氧嘧啶处理细胞1 h,链平均损伤频率由对照的0.11个/分子增加至5.60个/分子,明显增加了mtDNA上核苷酸的氧化损伤,除去药物后8 h,绝大部分损伤可被修复,损伤频率减至0.40个/分子,除去药物后24h核苷酸的氧化损伤恢复至正常水平.采用接头介导PCR(LM-PCR)检测MTTL1基因区域内单个核苷酸的损伤与修复动力学.这种方法可以检测各组mtDNA上MTTL1基因75 bp区域内单个核苷酸损伤的部位及频率.结果显示,人MTTL1基因存在20个易受氧化损伤的核苷酸热点,经与相应区域内文献报道的16个突变热点比较,有12个热点部位重合,而修复未显示热点部位或区域.结果提示,自由基对核苷酸的选择性氧化损伤是决定mtDNA点突变发生及发生部位的主要原因.
인mtDNA비핵DNA경역수도자유기적양화손상,저사손상가이피선립체내적DNA수복궤제소수복,손상여수복시결정돌변시부산생적량개중요인소.위료학정양화손상여손상후수복대mtDNA돌변적구체영향,채용사양밀정처리LO2세포,저충시제진입세포후,경양화환원반응생성적자유기여선립체자신대사산생적자유기유사,연후관찰자유기대세포mtDNA적양화손상여손상후DNA수복적동역학변화.유우선립체적정상공능위수복궤제소필수,채용MTT세포활력실험검측불동농도사양밀정처리하선립체매활력,발현9 mmol/L사양밀정배양세포1h후,선립체호박산탈경매공능재철거약물후0,2,8화24 h시간점균무명현변화.제취각조세포적mtDNA,용EndoⅢ화Fgp량충매절제수양화손상적핵감산,연후용감성경지당응효전영분리대소불등적mtDNA,진행DNA인적실험,지고신-항체-감성린산매계통현색,검측완정여단렬적mtDNA량,이용Poisson공식(s=-lnP0/P,P0위미단렬련광밀도치,P위소유련광밀도치총화)계산일개mtDNA분자적평균손상빈솔,결과현시,9 mmol/L사양밀정처리세포1 h,련평균손상빈솔유대조적0.11개/분자증가지5.60개/분자,명현증가료mtDNA상핵감산적양화손상,제거약물후8 h,절대부분손상가피수복,손상빈솔감지0.40개/분자,제거약물후24h핵감산적양화손상회복지정상수평.채용접두개도PCR(LM-PCR)검측MTTL1기인구역내단개핵감산적손상여수복동역학.저충방법가이검측각조mtDNA상MTTL1기인75 bp구역내단개핵감산손상적부위급빈솔.결과현시,인MTTL1기인존재20개역수양화손상적핵감산열점,경여상응구역내문헌보도적16개돌변열점비교,유12개열점부위중합,이수복미현시열점부위혹구역.결과제시,자유기대핵감산적선택성양화손상시결정mtDNA점돌변발생급발생부위적주요원인.