生物化学与生物物理进展
生物化學與生物物理進展
생물화학여생물물리진전
PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS
2004年
2期
118-126
,共9页
来大志%翁少洁%于长明%齐连权%付玲%于婷%陈薇
來大誌%翁少潔%于長明%齊連權%付玲%于婷%陳薇
래대지%옹소길%우장명%제련권%부령%우정%진미
转录激活因子%启动子%基因表达%cⅠ蛋白%CHO细胞
轉錄激活因子%啟動子%基因錶達%cⅠ蛋白%CHO細胞
전록격활인자%계동자%기인표체%cⅠ단백%CHO세포
表达载体的设计对于提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达量十分重要.而表达载体中最为重要的元件是启动子.一些常用病毒来源的启动子,如巨细胞病毒即早期启动子(PCMV-IE)仅在S期激活,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖,这对于连续持久大规模培养的宿主细胞不现实.而人延伸因子lα亚基启动子(PEF-1α)不受细胞周期限制,且启动子强度高于PCMV-IE,对于大规模外源蛋白的生产较为理想.首先构建子基于 PEF-1α启动子的哺乳动物细胞表达载体pED5,在增殖缓慢的CHO细胞中,此载体表达外源蛋白的能力是应用PCMV-IE启动子表达载体的4.1倍.由于启动子一般仅能决定基因转录的本底水平.而转录激活因子(transeription activtors)对基因转录的影响更大,所以另把两个人工转录激活结构域AH和VP2接到λ噬菌体cⅠ蛋白的C端,它们通过cⅠ蛋白结合于已插入到PEF-1α启动子的TATA框上游约200 bp的λ噬菌体OR2～OR1序列l,而被"征募"到PEF-1α启动子TATA框附近,从而促进基因的转录.把上述元件均整合进一个表达载体中,构建了两个新型表达载体pER～AH和pER-VP2.pER-AH表达外源蛋白的能力比不含转录激活因子的表达载体略高,而pER-VP2表达外源蛋白的能力则比不含转录激活因子的表达载体高2.7倍.
錶達載體的設計對于提高外源基因在哺乳動物細胞中的錶達量十分重要.而錶達載體中最為重要的元件是啟動子.一些常用病毒來源的啟動子,如巨細胞病毒即早期啟動子(PCMV-IE)僅在S期激活,應用這類啟動子錶達外源蛋白需要宿主細胞不停增殖,這對于連續持久大規模培養的宿主細胞不現實.而人延伸因子lα亞基啟動子(PEF-1α)不受細胞週期限製,且啟動子彊度高于PCMV-IE,對于大規模外源蛋白的生產較為理想.首先構建子基于 PEF-1α啟動子的哺乳動物細胞錶達載體pED5,在增殖緩慢的CHO細胞中,此載體錶達外源蛋白的能力是應用PCMV-IE啟動子錶達載體的4.1倍.由于啟動子一般僅能決定基因轉錄的本底水平.而轉錄激活因子(transeription activtors)對基因轉錄的影響更大,所以另把兩箇人工轉錄激活結構域AH和VP2接到λ噬菌體cⅠ蛋白的C耑,它們通過cⅠ蛋白結閤于已插入到PEF-1α啟動子的TATA框上遊約200 bp的λ噬菌體OR2～OR1序列l,而被"徵募"到PEF-1α啟動子TATA框附近,從而促進基因的轉錄.把上述元件均整閤進一箇錶達載體中,構建瞭兩箇新型錶達載體pER～AH和pER-VP2.pER-AH錶達外源蛋白的能力比不含轉錄激活因子的錶達載體略高,而pER-VP2錶達外源蛋白的能力則比不含轉錄激活因子的錶達載體高2.7倍.
표체재체적설계대우제고외원기인재포유동물세포중적표체량십분중요.이표체재체중최위중요적원건시계동자.일사상용병독래원적계동자,여거세포병독즉조기계동자(PCMV-IE)부재S기격활,응용저류계동자표체외원단백수요숙주세포불정증식,저대우련속지구대규모배양적숙주세포불현실.이인연신인자lα아기계동자(PEF-1α)불수세포주기한제,차계동자강도고우PCMV-IE,대우대규모외원단백적생산교위이상.수선구건자기우 PEF-1α계동자적포유동물세포표체재체pED5,재증식완만적CHO세포중,차재체표체외원단백적능력시응용PCMV-IE계동자표체재체적4.1배.유우계동자일반부능결정기인전록적본저수평.이전록격활인자(transeription activtors)대기인전록적영향경대,소이령파량개인공전록격활결구역AH화VP2접도λ서균체cⅠ단백적C단,타문통과cⅠ단백결합우이삽입도PEF-1α계동자적TATA광상유약200 bp적λ서균체OR2～OR1서렬l,이피"정모"도PEF-1α계동자TATA광부근,종이촉진기인적전록.파상술원건균정합진일개표체재체중,구건료량개신형표체재체pER～AH화pER-VP2.pER-AH표체외원단백적능력비불함전록격활인자적표체재체략고,이pER-VP2표체외원단백적능력칙비불함전록격활인자적표체재체고2.7배.
