第三军医大学学报
第三軍醫大學學報
제삼군의대학학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE
2007年
24期
2361-2363
,共3页
郑宏庭%邓华聪%兰丽珍%方芳%刘金波%李丙蓉%蹇锐
鄭宏庭%鄧華聰%蘭麗珍%方芳%劉金波%李丙蓉%蹇銳
정굉정%산화총%란려진%방방%류금파%리병용%건예
mhPINS基因%逆转录病毒%HepG2细胞%胰岛素
mhPINS基因%逆轉錄病毒%HepG2細胞%胰島素
mhPINS기인%역전록병독%HepG2세포%이도소
目的 构建稳定表达人胰岛素原突变(mutated human proinsulin,mhPINS)基因的HepG2细胞,将HepG2细胞改建为具有胰岛素分泌能力的"胰岛代理细胞"(artificial beta cell).方法 重组逆转录病毒载体pL-mhPINS-SN转包装细胞PA317,经G418筛选,NIH3T3细胞测定病毒滴度,获取高滴度的稳定产毒细胞克隆,以PCR进行鉴定.以mhPINS病毒感染HepG2细胞,经G418筛选,对HepG2/mhPINS细胞进行RT-PCR、Western blot、放免法鉴定,并行葡萄糖刺激的胰岛素分泌检测.结果 所获HepG2/mhPINS细胞生长良好,RT-PCR获得286 bp目的条带,Western blot检测可见34×103的特异性条带,放免法在其培养上清中检测到胰岛素与C肽,而HepG2/pLXSN细胞上述各项检测均为阴性.葡萄糖刺激的胰岛素分泌检测显示,HepG2/mhPINS细胞在不同葡萄糖浓度(0.1、10、20 mmol/L)条件下引起的胰岛素分泌无显著性差异(P＞0.05).结论 成功构建稳定表达mhPINS基因的HepG2细胞,其内获得成熟胰岛素的表达与分泌,但其胰岛素分泌对葡萄糖刺激缺乏反应.
目的 構建穩定錶達人胰島素原突變(mutated human proinsulin,mhPINS)基因的HepG2細胞,將HepG2細胞改建為具有胰島素分泌能力的"胰島代理細胞"(artificial beta cell).方法 重組逆轉錄病毒載體pL-mhPINS-SN轉包裝細胞PA317,經G418篩選,NIH3T3細胞測定病毒滴度,穫取高滴度的穩定產毒細胞剋隆,以PCR進行鑒定.以mhPINS病毒感染HepG2細胞,經G418篩選,對HepG2/mhPINS細胞進行RT-PCR、Western blot、放免法鑒定,併行葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測.結果 所穫HepG2/mhPINS細胞生長良好,RT-PCR穫得286 bp目的條帶,Western blot檢測可見34×103的特異性條帶,放免法在其培養上清中檢測到胰島素與C肽,而HepG2/pLXSN細胞上述各項檢測均為陰性.葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測顯示,HepG2/mhPINS細胞在不同葡萄糖濃度(0.1、10、20 mmol/L)條件下引起的胰島素分泌無顯著性差異(P＞0.05).結論 成功構建穩定錶達mhPINS基因的HepG2細胞,其內穫得成熟胰島素的錶達與分泌,但其胰島素分泌對葡萄糖刺激缺乏反應.
목적 구건은정표체인이도소원돌변(mutated human proinsulin,mhPINS)기인적HepG2세포,장HepG2세포개건위구유이도소분비능력적"이도대리세포"(artificial beta cell).방법 중조역전록병독재체pL-mhPINS-SN전포장세포PA317,경G418사선,NIH3T3세포측정병독적도,획취고적도적은정산독세포극륭,이PCR진행감정.이mhPINS병독감염HepG2세포,경G418사선,대HepG2/mhPINS세포진행RT-PCR、Western blot、방면법감정,병행포도당자격적이도소분비검측.결과 소획HepG2/mhPINS세포생장량호,RT-PCR획득286 bp목적조대,Western blot검측가견34×103적특이성조대,방면법재기배양상청중검측도이도소여C태,이HepG2/pLXSN세포상술각항검측균위음성.포도당자격적이도소분비검측현시,HepG2/mhPINS세포재불동포도당농도(0.1、10、20 mmol/L)조건하인기적이도소분비무현저성차이(P＞0.05).결론 성공구건은정표체mhPINS기인적HepG2세포,기내획득성숙이도소적표체여분비,단기이도소분비대포도당자격결핍반응.
