草业学报
草業學報
초업학보
PRATACULTURAL SCIENCE
2011年
1期
242-247
,共6页
曹丽%义鸣放%孙振元%韩蕾%巨关升%马欣荣
曹麗%義鳴放%孫振元%韓蕾%巨關升%馬訢榮
조려%의명방%손진원%한뢰%거관승%마흔영
多年生黑麦草%定点突变技术%脯氨酸合成酶基因%农杆菌转化
多年生黑麥草%定點突變技術%脯氨痠閤成酶基因%農桿菌轉化
다년생흑맥초%정점돌변기술%포안산합성매기인%농간균전화
在前期克隆获得LpP5CS基因的全长cDNA序列基础上,采用PCR扩增技术对多年生黑麦草脯氨酸合成酶基因P5CS的定点突变体系进行了探讨,并运用农杆菌转化技术对突变后的基因进行了功能验证.根据突变位点序列设计一对引物,使用Pfu高保真DNA聚合酶和超级感受态细胞DMT,通过PCR扩增,获得含有所要突变位点的LpP5CSF128A,定向克隆人真核表达载体pCAMBIA130.中,转化拟南芥验证基因功能.结果表明,预期位点上发生了突变,LpP5CS编码的第128位密码子已由苯丙氨酸残基(Phenylalanine,简称Phe或F)变为丙氨酸残基(Alanine,Ala),证明用PCR技术已成功地使LpP5CS基因发生定点突变.转基因拟南芥T:代植株进行PCR和RT-PCR检测,获得4个转基因阳性株系.拟南芥T:代植株经100 mmol/L NaCI处理7d后,转基因株系脯氨酸含量分别为4 262和5 623 Ag/g FW,显著高于野生型株系的2 581 leg/g FW.说明转基因株系能积累更多地脯氨酸.
在前期剋隆穫得LpP5CS基因的全長cDNA序列基礎上,採用PCR擴增技術對多年生黑麥草脯氨痠閤成酶基因P5CS的定點突變體繫進行瞭探討,併運用農桿菌轉化技術對突變後的基因進行瞭功能驗證.根據突變位點序列設計一對引物,使用Pfu高保真DNA聚閤酶和超級感受態細胞DMT,通過PCR擴增,穫得含有所要突變位點的LpP5CSF128A,定嚮剋隆人真覈錶達載體pCAMBIA130.中,轉化擬南芥驗證基因功能.結果錶明,預期位點上髮生瞭突變,LpP5CS編碼的第128位密碼子已由苯丙氨痠殘基(Phenylalanine,簡稱Phe或F)變為丙氨痠殘基(Alanine,Ala),證明用PCR技術已成功地使LpP5CS基因髮生定點突變.轉基因擬南芥T:代植株進行PCR和RT-PCR檢測,穫得4箇轉基因暘性株繫.擬南芥T:代植株經100 mmol/L NaCI處理7d後,轉基因株繫脯氨痠含量分彆為4 262和5 623 Ag/g FW,顯著高于野生型株繫的2 581 leg/g FW.說明轉基因株繫能積纍更多地脯氨痠.
재전기극륭획득LpP5CS기인적전장cDNA서렬기출상,채용PCR확증기술대다년생흑맥초포안산합성매기인P5CS적정점돌변체계진행료탐토,병운용농간균전화기술대돌변후적기인진행료공능험증.근거돌변위점서렬설계일대인물,사용Pfu고보진DNA취합매화초급감수태세포DMT,통과PCR확증,획득함유소요돌변위점적LpP5CSF128A,정향극륭인진핵표체재체pCAMBIA130.중,전화의남개험증기인공능.결과표명,예기위점상발생료돌변,LpP5CS편마적제128위밀마자이유분병안산잔기(Phenylalanine,간칭Phe혹F)변위병안산잔기(Alanine,Ala),증명용PCR기술이성공지사LpP5CS기인발생정점돌변.전기인의남개T:대식주진행PCR화RT-PCR검측,획득4개전기인양성주계.의남개T:대식주경100 mmol/L NaCI처리7d후,전기인주계포안산함량분별위4 262화5 623 Ag/g FW,현저고우야생형주계적2 581 leg/g FW.설명전기인주계능적루경다지포안산.
