四川大学学报（医学版）
四川大學學報（醫學版）
사천대학학보（의학판）
JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE EDITION)
2009年
2期
203-207
,共5页
张明娟%杨军%朱参战%段宗明%牛小麟%王蓉%宋雅燔
張明娟%楊軍%硃參戰%段宗明%牛小麟%王蓉%宋雅燔
장명연%양군%주삼전%단종명%우소린%왕용%송아번
钠泵α3亚单位%截断性片段%GST融合基因表达系统
鈉泵α3亞單位%截斷性片段%GST融閤基因錶達繫統
납빙α3아단위%절단성편단%GST융합기인표체계통
目的 构建重组pGEX-6P-1原核表达载体,表达和纯化大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区的截断性片段. 方法 利用In-fusion技术将钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区基因片段插入线性化的pGEX-6P-1载体中,转化,提取质粒,PCR鉴定;用阳性重组质粒pGEX-Trf-α3转化大肠杆菌,IPTG诱导、表达融合蛋白GST-Trf-α3.采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白, SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性及含量.采用放射性配体结合法检测其生物活性.结果 PCR和基因测序分析显示大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区被成功插入pGEX-6P-1载体GST基因3′端,蛋白序列分析表明GST-Trf-α3融合蛋白总长度262个氨基酸,理论相对分子质量应约为33.22×103.IPTG诱导后,GST-Trf-α3融合蛋白的表达量为10%,多以可溶性形式存在,可溶性蛋白表达量为80.8%.SDS-PAGE结果 显示其纯度>95%.生物活性实验结果 显示GST-Trf-α3融合蛋白与3H-哇巴因具有一定的结合能力,但结合能力较弱.结论 采用In-fusion技术成功构建了表达GST-Trf-α3融合蛋白的原核表达载体,建立了纯化方法 ,获得高纯度的融合蛋白,为钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区功能以及其潜在的药理学作用研究获得了实验数据.
目的 構建重組pGEX-6P-1原覈錶達載體,錶達和純化大鼠鈉泵α3亞單位M1～M2和M3～M4膜外區的截斷性片段. 方法 利用In-fusion技術將鈉泵α3亞單位M1～M2和M3～M4膜外區基因片段插入線性化的pGEX-6P-1載體中,轉化,提取質粒,PCR鑒定;用暘性重組質粒pGEX-Trf-α3轉化大腸桿菌,IPTG誘導、錶達融閤蛋白GST-Trf-α3.採用Glutathione Sepharose 4B親和層析純化融閤蛋白, SDS-PAGE電泳分析錶達產物的可溶性及含量.採用放射性配體結閤法檢測其生物活性.結果 PCR和基因測序分析顯示大鼠鈉泵α3亞單位M1～M2和M3～M4膜外區被成功插入pGEX-6P-1載體GST基因3′耑,蛋白序列分析錶明GST-Trf-α3融閤蛋白總長度262箇氨基痠,理論相對分子質量應約為33.22×103.IPTG誘導後,GST-Trf-α3融閤蛋白的錶達量為10%,多以可溶性形式存在,可溶性蛋白錶達量為80.8%.SDS-PAGE結果 顯示其純度>95%.生物活性實驗結果 顯示GST-Trf-α3融閤蛋白與3H-哇巴因具有一定的結閤能力,但結閤能力較弱.結論 採用In-fusion技術成功構建瞭錶達GST-Trf-α3融閤蛋白的原覈錶達載體,建立瞭純化方法 ,穫得高純度的融閤蛋白,為鈉泵α3亞單位M1～M2和M3～M4膜外區功能以及其潛在的藥理學作用研究穫得瞭實驗數據.
목적 구건중조pGEX-6P-1원핵표체재체,표체화순화대서납빙α3아단위M1～M2화M3～M4막외구적절단성편단. 방법 이용In-fusion기술장납빙α3아단위M1～M2화M3～M4막외구기인편단삽입선성화적pGEX-6P-1재체중,전화,제취질립,PCR감정;용양성중조질립pGEX-Trf-α3전화대장간균,IPTG유도、표체융합단백GST-Trf-α3.채용Glutathione Sepharose 4B친화층석순화융합단백, SDS-PAGE전영분석표체산물적가용성급함량.채용방사성배체결합법검측기생물활성.결과 PCR화기인측서분석현시대서납빙α3아단위M1～M2화M3～M4막외구피성공삽입pGEX-6P-1재체GST기인3′단,단백서렬분석표명GST-Trf-α3융합단백총장도262개안기산,이론상대분자질량응약위33.22×103.IPTG유도후,GST-Trf-α3융합단백적표체량위10%,다이가용성형식존재,가용성단백표체량위80.8%.SDS-PAGE결과 현시기순도>95%.생물활성실험결과 현시GST-Trf-α3융합단백여3H-왜파인구유일정적결합능력,단결합능력교약.결론 채용In-fusion기술성공구건료표체GST-Trf-α3융합단백적원핵표체재체,건립료순화방법 ,획득고순도적융합단백,위납빙α3아단위M1～M2화M3～M4막외구공능이급기잠재적약이학작용연구획득료실험수거.
