中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2007年
27期
5417-5420
,共4页
高坤%镐英杰%张晖%裴福兴
高坤%鎬英傑%張暉%裴福興
고곤%호영걸%장휘%배복흥
RNA干扰%核激活因子受体配体%大鼠%成骨细胞%基因沉默
RNA榦擾%覈激活因子受體配體%大鼠%成骨細胞%基因沉默
RNA간우%핵격활인자수체배체%대서%성골세포%기인침묵
目的:利用RNA干扰技术抑制大鼠成骨细胞核激活因子受体配体(Ligand of receptor activator of NF-κB,RANKL)的表达,观察成骨细胞RANKL/骨保护素(osteoprotegerin,OPG)比值变化,探讨成骨细胞与破骨细胞生成的相关性.方法:实验于2006-05/10在四川大学华西医院移植免疫实验室(国家重点实验室)完成.①实验材料:体外化学合成4条RANKL序列特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),用Lipofectin2000TM转染成骨细胞.②实验方法:采用荧光实时定量聚合酶链反应检测RANKL mRNA的表达,筛选出最有效的干扰序列.③实验分组:分为最有效的siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组,每组设5个平行样本.采用免疫组织化学染色检测成骨细胞中RANKL、OPG蛋白的表达,观察FANKL/OPG比值变化.④实验评估:采用成骨细胞、破骨细胞共培养技术观察以上3组转染后的成骨细胞对破骨细胞生成的影响.结果:①4种siRNA敲除RANKL基因后mRNA的表达:4种siRNA转染成骨细胞后,相对空白对照组,siRNA4分子对RANKL mRNA的抑制作用最为明显,达到89%.siRNA1,siRNA3对RANKL mRNA的抑制作用大于50%,而siRNA2对RANKL mRNA的也有相当的抑制作用.②各组成骨细胞中RANKL和OPG蛋白水平:RANKL和OPG的阳性表达均显示为棕黄色颗粒,RANKL主要分布于成骨细胞的胞浆和胞膜,OPG主要分布于成骨细胞的胞浆.siRNA4转染组RANKL表达(平均积分光密度值)低于空白对照组(分别为3.05±2.17,11.31±1.26),差异有显著性意义(P＜0.01);阴性对照组与空白对照相比,差异无显著性意义(P＞0.05).siRNA4转染组、阴性对照组OPG表达与空白对照组比较,差异均无显著性意义(P＞0.05).siRNA4转染组RANKL/OPG比值低于空白对照组(分别为0.12±0.03,0.45±0.04),差异有显著性意义(P＜0.01).③转染的成骨细胞对破骨细胞生成的影响:各组共培养形成的破骨细胞形态与分离的成熟破骨细胞相似,为不规则形,胞浆红染,并有伪足形成.siRNA4转染组破骨细胞形成低于空白对照组、阴性对照组[分别为(12±2),(31±7),(28±5)个/孔],差异有显著性意义(P＜0.01);阴性对照组与空白对照相比,差异无显著性意义(P＞0.05).结论:RNA干扰沉默RANKL表达可下调成骨细胞RANKL/OPG比值,抑制破骨细胞的生成.
目的:利用RNA榦擾技術抑製大鼠成骨細胞覈激活因子受體配體(Ligand of receptor activator of NF-κB,RANKL)的錶達,觀察成骨細胞RANKL/骨保護素(osteoprotegerin,OPG)比值變化,探討成骨細胞與破骨細胞生成的相關性.方法:實驗于2006-05/10在四川大學華西醫院移植免疫實驗室(國傢重點實驗室)完成.①實驗材料:體外化學閤成4條RANKL序列特異性小榦擾RNA(small interfering RNA,siRNA),用Lipofectin2000TM轉染成骨細胞.②實驗方法:採用熒光實時定量聚閤酶鏈反應檢測RANKL mRNA的錶達,篩選齣最有效的榦擾序列.③實驗分組:分為最有效的siRNA轉染組、陰性對照組和空白對照組,每組設5箇平行樣本.採用免疫組織化學染色檢測成骨細胞中RANKL、OPG蛋白的錶達,觀察FANKL/OPG比值變化.④實驗評估:採用成骨細胞、破骨細胞共培養技術觀察以上3組轉染後的成骨細胞對破骨細胞生成的影響.結果:①4種siRNA敲除RANKL基因後mRNA的錶達:4種siRNA轉染成骨細胞後,相對空白對照組,siRNA4分子對RANKL mRNA的抑製作用最為明顯,達到89%.siRNA1,siRNA3對RANKL mRNA的抑製作用大于50%,而siRNA2對RANKL mRNA的也有相噹的抑製作用.②各組成骨細胞中RANKL和OPG蛋白水平:RANKL和OPG的暘性錶達均顯示為棕黃色顆粒,RANKL主要分佈于成骨細胞的胞漿和胞膜,OPG主要分佈于成骨細胞的胞漿.siRNA4轉染組RANKL錶達(平均積分光密度值)低于空白對照組(分彆為3.05±2.17,11.31±1.26),差異有顯著性意義(P＜0.01);陰性對照組與空白對照相比,差異無顯著性意義(P＞0.05).siRNA4轉染組、陰性對照組OPG錶達與空白對照組比較,差異均無顯著性意義(P＞0.05).siRNA4轉染組RANKL/OPG比值低于空白對照組(分彆為0.12±0.03,0.45±0.04),差異有顯著性意義(P＜0.01).③轉染的成骨細胞對破骨細胞生成的影響:各組共培養形成的破骨細胞形態與分離的成熟破骨細胞相似,為不規則形,胞漿紅染,併有偽足形成.siRNA4轉染組破骨細胞形成低于空白對照組、陰性對照組[分彆為(12±2),(31±7),(28±5)箇/孔],差異有顯著性意義(P＜0.01);陰性對照組與空白對照相比,差異無顯著性意義(P＞0.05).結論:RNA榦擾沉默RANKL錶達可下調成骨細胞RANKL/OPG比值,抑製破骨細胞的生成.
목적:이용RNA간우기술억제대서성골세포핵격활인자수체배체(Ligand of receptor activator of NF-κB,RANKL)적표체,관찰성골세포RANKL/골보호소(osteoprotegerin,OPG)비치변화,탐토성골세포여파골세포생성적상관성.방법:실험우2006-05/10재사천대학화서의원이식면역실험실(국가중점실험실)완성.①실험재료:체외화학합성4조RANKL서렬특이성소간우RNA(small interfering RNA,siRNA),용Lipofectin2000TM전염성골세포.②실험방법:채용형광실시정량취합매련반응검측RANKL mRNA적표체,사선출최유효적간우서렬.③실험분조:분위최유효적siRNA전염조、음성대조조화공백대조조,매조설5개평행양본.채용면역조직화학염색검측성골세포중RANKL、OPG단백적표체,관찰FANKL/OPG비치변화.④실험평고:채용성골세포、파골세포공배양기술관찰이상3조전염후적성골세포대파골세포생성적영향.결과:①4충siRNA고제RANKL기인후mRNA적표체:4충siRNA전염성골세포후,상대공백대조조,siRNA4분자대RANKL mRNA적억제작용최위명현,체도89%.siRNA1,siRNA3대RANKL mRNA적억제작용대우50%,이siRNA2대RANKL mRNA적야유상당적억제작용.②각조성골세포중RANKL화OPG단백수평:RANKL화OPG적양성표체균현시위종황색과립,RANKL주요분포우성골세포적포장화포막,OPG주요분포우성골세포적포장.siRNA4전염조RANKL표체(평균적분광밀도치)저우공백대조조(분별위3.05±2.17,11.31±1.26),차이유현저성의의(P＜0.01);음성대조조여공백대조상비,차이무현저성의의(P＞0.05).siRNA4전염조、음성대조조OPG표체여공백대조조비교,차이균무현저성의의(P＞0.05).siRNA4전염조RANKL/OPG비치저우공백대조조(분별위0.12±0.03,0.45±0.04),차이유현저성의의(P＜0.01).③전염적성골세포대파골세포생성적영향:각조공배양형성적파골세포형태여분리적성숙파골세포상사,위불규칙형,포장홍염,병유위족형성.siRNA4전염조파골세포형성저우공백대조조、음성대조조[분별위(12±2),(31±7),(28±5)개/공],차이유현저성의의(P＜0.01);음성대조조여공백대조상비,차이무현저성의의(P＞0.05).결론:RNA간우침묵RANKL표체가하조성골세포RANKL/OPG비치,억제파골세포적생성.
