CAJ | 학술논문

目的:构建并鉴定人canstatin基因腺病毒表达载体Ad-can及研究在卵巢癌的表达.方法:(1)提取人卵巢癌组织总RNA,设计带有特殊酶切位点的引物,用RT-PCR方法扩增canstatin片段,克隆入载体pMD-18T,并转化至大肠杆菌DH5α,大量扩增目的基因(pMD-can);(2)双酶切pMD-can和pAdtrack质粒,酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接,获得pAdtrack-canstatin(pAdtr-can)穿梭载体;(3)Pme I酶切pAdtr-can,使其线性化,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy共同转化大肠杆菌BJ5183,使其同源重组,获得pADeasy-canstatin(pAd-can)载体;(4)内切酶Pac I再次将重组子线性化,脂质体转染细胞株HEK293,借助GFP表达观察包装病毒Ad-can.重组腺病毒载体感染HEK293细胞扩增病毒,经4次扩增、纯化后,用空斑形成实验法测病毒滴度;(5)用包装的病毒转染卵巢癌细胞H08910PM,借助GFP的荧光表达观察卵巢癌细胞转染情况;(6)RT-PCR检测转染后卵巢癌细胞中目的基因的表达.结果:各中间载体经酶切鉴定,DNA测序证实正确.转染的HEK293细胞2～3天产生病毒,7～10天出现病毒斑.最终包装的病毒中携带有目的基因canstatin,并能够在包装细胞中表达.用空斑形成实验法测定病毒滴度约为1.6×1011 pfu/ml.将包装的病毒转染卵巢癌细胞,荧光显微镜下可观察到大部分卵巢癌细胞发出绿色荧光,经RT-PCR检测可发现canstatin基因扩增片段.结论:大肠杆菌内同源重组法能有效和较方便的构建canstatin基因腺病毒载体Ad-can.重组子Ad-can能转染卵巢癌细胞,并在卵巢癌细胞中表达,为进一步研究canstatin基因治疗卵巢肿瘤提供了良好的转导载体.
목적:구건병감정인canstatin기인선병독표체재체Ad-can급연구재란소암적표체.방법:(1)제취인란소암조직총RNA,설계대유특수매절위점적인물,용RT-PCR방법확증canstatin편단,극륭입재체pMD-18T,병전화지대장간균DH5α,대량확증목적기인(pMD-can);(2)쌍매절pMD-can화pAdtrack질립,매절산물재T4DNA련접매작용하련접,획득pAdtrack-canstatin(pAdtr-can)천사재체;(3)Pme I매절pAdtr-can,사기선성화,병여선병독골가질립pAdeasy공동전화대장간균BJ5183,사기동원중조,획득pADeasy-canstatin(pAd-can)재체;(4)내절매Pac I재차장중조자선성화,지질체전염세포주HEK293,차조GFP표체관찰포장병독Ad-can.중조선병독재체감염HEK293세포확증병독,경4차확증、순화후,용공반형성실험법측병독적도;(5)용포장적병독전염란소암세포H08910PM,차조GFP적형광표체관찰란소암세포전염정황;(6)RT-PCR검측전염후란소암세포중목적기인적표체.결과:각중간재체경매절감정,DNA측서증실정학.전염적HEK293세포2～3천산생병독,7～10천출현병독반.최종포장적병독중휴대유목적기인canstatin,병능구재포장세포중표체.용공반형성실험법측정병독적도약위1.6×1011 pfu/ml.장포장적병독전염란소암세포,형광현미경하가관찰도대부분란소암세포발출록색형광,경RT-PCR검측가발현canstatin기인확증편단.결론:대장간균내동원중조법능유효화교방편적구건canstatin기인선병독재체Ad-can.중조자Ad-can능전염란소암세포,병재란소암세포중표체,위진일보연구canstatin기인치료란소종류제공료량호적전도재체.