CAJ | 학술논문

克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(SeFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定.采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性.结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL.采用Sarkoeyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性.实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化.
극륭항인종류배사인자(TNF-α)서원단항적가변구기인이구건기단련항체(SeFv)표체재체,실현재대장간균적표체,병진행ScFv적가용성순화여감정.채용RT-PCR기술,이전도태서렬적인물종1개분비항인TNF-α적서단항잡교류세포계중극륭항체경련、중련가변구기인(VL,VH),구건ScFv기인,장ScFv기인편단여pGEX-4T-1표체재체련접,재대장간균중표체병채용십이완기기안산납(Sarkosyl)진행가용성순화,최후감정기생물활성.결과현시,득도료공능성중배적경、중련가변구기인,분별구건료VH화VL불동련접순서적HLL(VH-Linker-VL)화LLH(VL-Linker-VH)량충ScFv,LLH적표체량교HLL적고,단친화력불급HLL.채용Sarkoeyl용해포함체,대목적단백진행가용성순화,단백순도체도90%,순화후적단백경ELISA화WB증명ScFv유지료친본항체여TNF-α특이성결합적능력,차구유세포독중화활성.실험중연구탐색료일충신영적,조작간단,성시적렬해、순화방안,실현료단련항체경원핵계통적표체후득이가용성순화.