中华实验外科杂志
中華實驗外科雜誌
중화실험외과잡지
CHINESE JOURNAL OF EXPERIMENTAL SURGERY
2005年
12期
1559-1561
,共3页
钱建民%芮晓晖%史留斌%王乾伟%李国祥
錢建民%芮曉暉%史留斌%王乾偉%李國祥
전건민%예효휘%사류빈%왕건위%리국상
MHCⅡ%免疫耐受%骨髓细胞%逆转录病毒载体
MHCⅡ%免疫耐受%骨髓細胞%逆轉錄病毒載體
MHCⅡ%면역내수%골수세포%역전록병독재체
目的构建猪MHCⅡ分子的反转录病毒表达载体,建立产生病毒颗粒的包装细胞株,体外转导小型猪骨髓细胞并观察目的基因的表达情况,为研究小型猪转导同种异体MHCⅡ分子对于肝脏移植特异性免疫耐受的诱导提供实验基础和实验材料.方法利用基因重组技术将目的基因SLA-DRBdd、SLA-DQAdd和SLA-DQBdd克隆到反转录病毒载体pLNCX2上,通过脂质体转染包装细胞AmphoPackTM-293细胞,从G418筛选阳性克隆细胞培养上清中获得了有感染性的病毒颗粒;并对体外培养的猪骨髓细胞进行了感染,采用Nothem杂交和逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)等方法检测了目的基因在骨髓细胞中的表达.结果经过酶切和测序验证已成功构建了MHCⅡ分子的反转录病毒表达载体,在转染AmphoPackTM-293细胞后可以产生有感染性的重组病毒颗粒,稳定的CFM-GFG418抗性率为6%～11%,RT结果显示抗性细胞中有目的基因的RNA转录产物存在,而转染空载体的对照组没有.结论重组有目的基因的逆转录病毒载体pLNCX2经过包装细胞AmphoPackTM-293产生的病毒颗粒可以有效地将猪MHCⅡ分子转导入猪的骨髓细胞并获得长期稳定的表达.
目的構建豬MHCⅡ分子的反轉錄病毒錶達載體,建立產生病毒顆粒的包裝細胞株,體外轉導小型豬骨髓細胞併觀察目的基因的錶達情況,為研究小型豬轉導同種異體MHCⅡ分子對于肝髒移植特異性免疫耐受的誘導提供實驗基礎和實驗材料.方法利用基因重組技術將目的基因SLA-DRBdd、SLA-DQAdd和SLA-DQBdd剋隆到反轉錄病毒載體pLNCX2上,通過脂質體轉染包裝細胞AmphoPackTM-293細胞,從G418篩選暘性剋隆細胞培養上清中穫得瞭有感染性的病毒顆粒;併對體外培養的豬骨髓細胞進行瞭感染,採用Nothem雜交和逆轉錄-聚閤酶鏈反應(RTPCR)等方法檢測瞭目的基因在骨髓細胞中的錶達.結果經過酶切和測序驗證已成功構建瞭MHCⅡ分子的反轉錄病毒錶達載體,在轉染AmphoPackTM-293細胞後可以產生有感染性的重組病毒顆粒,穩定的CFM-GFG418抗性率為6%～11%,RT結果顯示抗性細胞中有目的基因的RNA轉錄產物存在,而轉染空載體的對照組沒有.結論重組有目的基因的逆轉錄病毒載體pLNCX2經過包裝細胞AmphoPackTM-293產生的病毒顆粒可以有效地將豬MHCⅡ分子轉導入豬的骨髓細胞併穫得長期穩定的錶達.
목적구건저MHCⅡ분자적반전록병독표체재체,건립산생병독과립적포장세포주,체외전도소형저골수세포병관찰목적기인적표체정황,위연구소형저전도동충이체MHCⅡ분자대우간장이식특이성면역내수적유도제공실험기출화실험재료.방법이용기인중조기술장목적기인SLA-DRBdd、SLA-DQAdd화SLA-DQBdd극륭도반전록병독재체pLNCX2상,통과지질체전염포장세포AmphoPackTM-293세포,종G418사선양성극륭세포배양상청중획득료유감염성적병독과립;병대체외배양적저골수세포진행료감염,채용Nothem잡교화역전록-취합매련반응(RTPCR)등방법검측료목적기인재골수세포중적표체.결과경과매절화측서험증이성공구건료MHCⅡ분자적반전록병독표체재체,재전염AmphoPackTM-293세포후가이산생유감염성적중조병독과립,은정적CFM-GFG418항성솔위6%～11%,RT결과현시항성세포중유목적기인적RNA전록산물존재,이전염공재체적대조조몰유.결론중조유목적기인적역전록병독재체pLNCX2경과포장세포AmphoPackTM-293산생적병독과립가이유효지장저MHCⅡ분자전도입저적골수세포병획득장기은정적표체.
