CAJ | 학술논문

背景:一些基础研究成果对于新生血管形成和内皮祖细胞的自动募集机制已做出了合理的解释,体外培养的内皮祖细胞可分化为成熟的内皮细胞,有助于血管内皮修复.目的:拟建立从紫绀型先天性心脏病患儿外周血获取内皮祖细胞的方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08/2008-04在中南大学湘雅二医院完成.材料:外周血来源于2007-10/12中南大学湘雅二医院胸外科收治的15例法洛四联症患儿,安静状态下末梢氧饱和度为(78.0±5.0)%.方法:采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞,以含体积分数为0.2的胎牛血清、4 mg/L牛脑垂体提取物、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL氨苄青霉索、100g/L硫酸链霉素的M199培养基进行体外诱导分化,调整细胞密度为2×109L-1,接种至预铺人纤维连接蛋白的6孔培养板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下,贴壁法纯化培养10d.主要观察指标:细胞形态和生长情况,Di1标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC标记的荆豆凝集素双荧光染色鉴定结果,vWF、CD34及CD31免疫组化鉴定结果,PE标记CD133抗体与藻蓝蛋白标记KDR抗体免疫荧光鉴定结果,透射电镜观察内皮祖细胞特征细胞器.结果:接种后0.5 h细胞贴壁生长,培养第7天形成典型的细胞集落,第14天呈铺路石样外观,细胞数量级可达108.培养第10天,贴壁细胞中70%呈Di1标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC-UEA-I双阳性,为正在分化的内皮祖细胞:vWF、CD34及CD31免疫组化染色均呈阳性表达:PE标记CD133抗体呈红色荧光,藻蓝蛋白标记KDR抗体呈蓝色荧光.透射电镜可见内皮祖细胞特征性幼稚线粒体及Weibel-Palade小体.结论:实验成功从紫绀型先天性心脏病患儿外周血中分离培养并获取高纯度的内皮祖细胞,且在体外稳定快速扩增.
배경:일사기출연구성과대우신생혈관형성화내피조세포적자동모집궤제이주출료합리적해석,체외배양적내피조세포가분화위성숙적내피세포,유조우혈관내피수복.목적:의건립종자감형선천성심장병환인외주혈획취내피조세포적방법.설계、시간급지점:세포학체외관찰,우2007-08/2008-04재중남대학상아이의원완성.재료:외주혈래원우2007-10/12중남대학상아이의원흉외과수치적15례법락사련증환인,안정상태하말소양포화도위(78.0±5.0)%.방법:채용Ficoll밀도제도리심법종외주혈중분리단개핵세포,이함체적분수위0.2적태우혈청、4 mg/L우뇌수체제취물、2mmol/L곡안선알、100U/mL안변청매색、100g/L류산련매소적M199배양기진행체외유도분화,조정세포밀도위2×109L-1,접충지예포인섬유련접단백적6공배양판,치우37℃、체적분수위0.05적CO2포화습도조건하,첩벽법순화배양10d.주요관찰지표:세포형태화생장정황,Di1표기적을선화저밀도지단백/FITC표기적형두응집소쌍형광염색감정결과,vWF、CD34급CD31면역조화감정결과,PE표기CD133항체여조람단백표기KDR항체면역형광감정결과,투사전경관찰내피조세포특정세포기.결과:접충후0.5 h세포첩벽생장,배양제7천형성전형적세포집락,제14천정포로석양외관,세포수량급가체108.배양제10천,첩벽세포중70%정Di1표기적을선화저밀도지단백/FITC-UEA-I쌍양성,위정재분화적내피조세포:vWF、CD34급CD31면역조화염색균정양성표체:PE표기CD133항체정홍색형광,조람단백표기KDR항체정람색형광.투사전경가견내피조세포특정성유치선립체급Weibel-Palade소체.결론:실험성공종자감형선천성심장병환인외주혈중분리배양병획취고순도적내피조세포,차재체외은정쾌속확증.