中国兽医学报
中國獸醫學報
중국수의학보
CHINESE JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE
2003年
3期
278-280
,共3页
郭海龙%童光志%仇华吉%周艳君%兰文生%王云峰%吴东来
郭海龍%童光誌%仇華吉%週豔君%蘭文生%王雲峰%吳東來
곽해룡%동광지%구화길%주염군%란문생%왕운봉%오동래
猪IFN-γ%竞争PCR%内对照%嵌入光密度
豬IFN-γ%競爭PCR%內對照%嵌入光密度
저IFN-γ%경쟁PCR%내대조%감입광밀도
运用RT-PCR从经ConA体外刺激培养的猪外周血单核细胞(PBMC)提取的细胞总RNA中扩增猪γ-干扰素(IFN-γ)的部分片段,经酶切鉴定后双酶切缺失中间一小片段,将余下的2个较大片段连接,并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物,从而获得截短的同源性片段.将其纯化后克隆于pMD18-T载体,重组质粒经酶切和PCR鉴定后进行序列测定,验证无误后作为竞争性模板内对照,一定比例稀释后分别与等体积经刺激培养的PBMC总RNA反转录产物进行PCR,产物电泳后经扫描分析获得各目标条带与竞争条带的溴化乙锭(EB)嵌入光密度值(IOD),经校正后取上述两者比值的对数值作为Y轴,取已知竞争模板相应浓度的对数值作为X轴,绘制成竞争曲线.应用建立的竞争PCR对不同样品重复试验表明,本方法操作简单,结果可靠,稳定性高,适用于猪IFN-γ mRNA的定量检测.
運用RT-PCR從經ConA體外刺激培養的豬外週血單覈細胞(PBMC)提取的細胞總RNA中擴增豬γ-榦擾素(IFN-γ)的部分片段,經酶切鑒定後雙酶切缺失中間一小片段,將餘下的2箇較大片段連接,併用相同的引物在相同條件下擴增連接產物,從而穫得截短的同源性片段.將其純化後剋隆于pMD18-T載體,重組質粒經酶切和PCR鑒定後進行序列測定,驗證無誤後作為競爭性模闆內對照,一定比例稀釋後分彆與等體積經刺激培養的PBMC總RNA反轉錄產物進行PCR,產物電泳後經掃描分析穫得各目標條帶與競爭條帶的溴化乙錠(EB)嵌入光密度值(IOD),經校正後取上述兩者比值的對數值作為Y軸,取已知競爭模闆相應濃度的對數值作為X軸,繪製成競爭麯線.應用建立的競爭PCR對不同樣品重複試驗錶明,本方法操作簡單,結果可靠,穩定性高,適用于豬IFN-γ mRNA的定量檢測.
운용RT-PCR종경ConA체외자격배양적저외주혈단핵세포(PBMC)제취적세포총RNA중확증저γ-간우소(IFN-γ)적부분편단,경매절감정후쌍매절결실중간일소편단,장여하적2개교대편단련접,병용상동적인물재상동조건하확증련접산물,종이획득절단적동원성편단.장기순화후극륭우pMD18-T재체,중조질립경매절화PCR감정후진행서렬측정,험증무오후작위경쟁성모판내대조,일정비례희석후분별여등체적경자격배양적PBMC총RNA반전록산물진행PCR,산물전영후경소묘분석획득각목표조대여경쟁조대적추화을정(EB)감입광밀도치(IOD),경교정후취상술량자비치적대수치작위Y축,취이지경쟁모판상응농도적대수치작위X축,회제성경쟁곡선.응용건립적경쟁PCR대불동양품중복시험표명,본방법조작간단,결과가고,은정성고,괄용우저IFN-γ mRNA적정량검측.
