CAJ | 학술논문

目的:观察从人胚胎胰腺体外分离培养的巢蛋白和神经元素3阳性细胞,分析其基因表达及诱导分化能力,探讨为胰腺组织工程移植提供种子细胞的可能性.方法:实验于2002-01/2004-05在北京大学干细胞中心完成.实验采用标本为北京市海淀妇产医院产科药物引产的人胚胎,引产药物为米索.使用的胚胎经孕妇同意,并签署同意书.选取18例胎龄为12～24周的人胚胰腺,用Ⅴ型胶原酶消化获得贴壁生长的人胚胰腺细胞,观察其原代培养、传代培养、增殖能力及体外诱导分化能力;胰腺干细胞标志巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达应用免疫荧光染色及反转录聚合酶链反应检测;细胞总蛋白中胰岛素含量应用化学发光法检测.结果:18例胎龄为12～24周的人胚胰腺全部纳入实验.①人胚胎胰腺组织体外培养和诱导分化:人胚胎胰腺组织消化后可获得胰岛样结构,能贴壁生长,传代20代以上,然后进入凋亡期.汇合的细胞加入诱导分化培养基,24h后即可见大部分细胞聚集成团;周围散在贴壁细胞突起细长,立体感增强.随着诱导时间的延长,细胞增殖缓慢,个别细胞脱落、死亡.细胞团易于脱落漂浮,继而死亡.但仍有部分细胞及细胞团贴壁生长.②巢蛋白、胰岛素、胰高血糖素、广谱角蛋白及角蛋白19含量测定:无论是第2代还是第10代细胞中均无胰岛素、胰高血糖素CK-Pan和CK-19染色阳性的细胞.第2代细胞中,巢蛋白阳性细胞约占总细胞数的20%,个别细胞核神经元素3阳性,多数细胞为两者均阴性.第10代细胞中95%以上为巢蛋白强阳性细胞,约90%细胞神经元素3阳性且阳性部位同时存在于细胞核和细胞质中,并与巢蛋白共表达.但第18代细胞,荧光染色神经元素3染色转阴性(反转录聚合酶链反应可检测到少量mRNA的表达),而巢蛋白阳性无明显变化.③诱导前后巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达:诱导前有巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因-1、神经元素3的表达,无胰岛素表达.诱导后出现胰岛素表达,胰十二指肠同源盒基因-1表达增高,巢蛋白和神经元素3表达下降.④胰岛素含量测定结果:诱导分化后,巢蛋白和神经元素3阳性细胞的总蛋白质中含有胰岛素量为2.10IU/g总蛋白,作为阳性对照的人胚胎胰腺组织总蛋白中的含量为2.70IU/g总蛋白,而未诱导的细胞的总蛋白质中未检测到胰岛素.结论:从人胚胎胰腺可以体外分离获得巢蛋白和神经元素3阳性人胚胎胰腺干细胞,为未分化细胞,能在体外大量扩增,可长期培养.总蛋白中有胰岛素表达,有分化为胰岛素阳性细胞的潜能,有望为胰腺组织工程移植提供足够的种子细胞. 目的:觀察從人胚胎胰腺體外分離培養的巢蛋白和神經元素3暘性細胞,分析其基因錶達及誘導分化能力,探討為胰腺組織工程移植提供種子細胞的可能性.方法:實驗于2002-01/2004-05在北京大學榦細胞中心完成.實驗採用標本為北京市海澱婦產醫院產科藥物引產的人胚胎,引產藥物為米索.使用的胚胎經孕婦同意,併籤署同意書.選取18例胎齡為12～24週的人胚胰腺,用Ⅴ型膠原酶消化穫得貼壁生長的人胚胰腺細胞,觀察其原代培養、傳代培養、增殖能力及體外誘導分化能力;胰腺榦細胞標誌巢蛋白和神經元素3暘性細胞及胰島素錶達應用免疫熒光染色及反轉錄聚閤酶鏈反應檢測;細胞總蛋白中胰島素含量應用化學髮光法檢測.結果:18例胎齡為12～24週的人胚胰腺全部納入實驗.①人胚胎胰腺組織體外培養和誘導分化:人胚胎胰腺組織消化後可穫得胰島樣結構,能貼壁生長,傳代20代以上,然後進入凋亡期.彙閤的細胞加入誘導分化培養基,24h後即可見大部分細胞聚集成糰;週圍散在貼壁細胞突起細長,立體感增彊.隨著誘導時間的延長,細胞增殖緩慢,箇彆細胞脫落、死亡.細胞糰易于脫落漂浮,繼而死亡.但仍有部分細胞及細胞糰貼壁生長.②巢蛋白、胰島素、胰高血糖素、廣譜角蛋白及角蛋白19含量測定:無論是第2代還是第10代細胞中均無胰島素、胰高血糖素CK-Pan和CK-19染色暘性的細胞.第2代細胞中,巢蛋白暘性細胞約佔總細胞數的20%,箇彆細胞覈神經元素3暘性,多數細胞為兩者均陰性.第10代細胞中95%以上為巢蛋白彊暘性細胞,約90%細胞神經元素3暘性且暘性部位同時存在于細胞覈和細胞質中,併與巢蛋白共錶達.但第18代細胞,熒光染色神經元素3染色轉陰性(反轉錄聚閤酶鏈反應可檢測到少量mRNA的錶達),而巢蛋白暘性無明顯變化.③誘導前後巢蛋白和神經元素3暘性細胞及胰島素錶達:誘導前有巢蛋白、胰十二指腸同源盒基因-1、神經元素3的錶達,無胰島素錶達.誘導後齣現胰島素錶達,胰十二指腸同源盒基因-1錶達增高,巢蛋白和神經元素3錶達下降.④胰島素含量測定結果:誘導分化後,巢蛋白和神經元素3暘性細胞的總蛋白質中含有胰島素量為2.10IU/g總蛋白,作為暘性對照的人胚胎胰腺組織總蛋白中的含量為2.70IU/g總蛋白,而未誘導的細胞的總蛋白質中未檢測到胰島素.結論:從人胚胎胰腺可以體外分離穫得巢蛋白和神經元素3暘性人胚胎胰腺榦細胞,為未分化細胞,能在體外大量擴增,可長期培養.總蛋白中有胰島素錶達,有分化為胰島素暘性細胞的潛能,有望為胰腺組織工程移植提供足夠的種子細胞.
목적:관찰종인배태이선체외분리배양적소단백화신경원소3양성세포,분석기기인표체급유도분화능력,탐토위이선조직공정이식제공충자세포적가능성.방법:실험우2002-01/2004-05재북경대학간세포중심완성.실험채용표본위북경시해정부산의원산과약물인산적인배태,인산약물위미색.사용적배태경잉부동의,병첨서동의서.선취18례태령위12～24주적인배이선,용Ⅴ형효원매소화획득첩벽생장적인배이선세포,관찰기원대배양、전대배양、증식능력급체외유도분화능력;이선간세포표지소단백화신경원소3양성세포급이도소표체응용면역형광염색급반전록취합매련반응검측;세포총단백중이도소함량응용화학발광법검측.결과:18례태령위12～24주적인배이선전부납입실험.①인배태이선조직체외배양화유도분화:인배태이선조직소화후가획득이도양결구,능첩벽생장,전대20대이상,연후진입조망기.회합적세포가입유도분화배양기,24h후즉가견대부분세포취집성단;주위산재첩벽세포돌기세장,입체감증강.수착유도시간적연장,세포증식완만,개별세포탈락、사망.세포단역우탈락표부,계이사망.단잉유부분세포급세포단첩벽생장.②소단백、이도소、이고혈당소、엄보각단백급각단백19함량측정:무론시제2대환시제10대세포중균무이도소、이고혈당소CK-Pan화CK-19염색양성적세포.제2대세포중,소단백양성세포약점총세포수적20%,개별세포핵신경원소3양성,다수세포위량자균음성.제10대세포중95%이상위소단백강양성세포,약90%세포신경원소3양성차양성부위동시존재우세포핵화세포질중,병여소단백공표체.단제18대세포,형광염색신경원소3염색전음성(반전록취합매련반응가검측도소량mRNA적표체),이소단백양성무명현변화.③유도전후소단백화신경원소3양성세포급이도소표체:유도전유소단백、이십이지장동원합기인-1、신경원소3적표체,무이도소표체.유도후출현이도소표체,이십이지장동원합기인-1표체증고,소단백화신경원소3표체하강.④이도소함량측정결과:유도분화후,소단백화신경원소3양성세포적총단백질중함유이도소량위2.10IU/g총단백,작위양성대조적인배태이선조직총단백중적함량위2.70IU/g총단백,이미유도적세포적총단백질중미검측도이도소.결론:종인배태이선가이체외분리획득소단백화신경원소3양성인배태이선간세포,위미분화세포,능재체외대량확증,가장기배양.총단백중유이도소표체,유분화위이도소양성세포적잠능,유망위이선조직공정이식제공족구적충자세포.