生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2008年
4期
592-597
,共6页
信丰学%王鹏%钟盛华%祁庆生
信豐學%王鵬%鐘盛華%祁慶生
신봉학%왕붕%종성화%기경생
N-糖酰胺酶%RT-PCR%Ribonuclease B%酶活测定
N-糖酰胺酶%RT-PCR%Ribonuclease B%酶活測定
N-당선알매%RT-PCR%Ribonuclease B%매활측정
根据GenBank中公布的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)N-糖酰胺酶(Png1p)cDNA序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR技术从粟酒裂殖酵母中克隆出糖酰胺酶cDNA.将得到的基因克隆到表达载体pET-15b中.重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导表达和纯化提取后,进行酶活测定.实验结果表明,该酶的分子量约为39 kD,纯化后的重组N-糖酰胺酶可以对变性处理的糖蛋白进行糖链的切除,且这种作用需要还原剂DTT的辅助作用;N-糖酰胺酶只对错误折叠的糖蛋白有作用,对天然的糖蛋白没有作用.等量粟酒裂殖酵母Png1p在不同温度、pH,DTT浓度和底物变性温度下对等量核糖核酸酶B(RNase B)的脱糖基化检测发现,重组酶的最适反应温度30℃,最适反应pH为7.0,需要的最适DTT浓度为10 mmol/L,底物在100℃处理10 min时酶的脱糖基化率最高.
根據GenBank中公佈的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)N-糖酰胺酶(Png1p)cDNA序列,設計併閤成一對特異性引物,利用RT-PCR技術從粟酒裂殖酵母中剋隆齣糖酰胺酶cDNA.將得到的基因剋隆到錶達載體pET-15b中.重組質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,經誘導錶達和純化提取後,進行酶活測定.實驗結果錶明,該酶的分子量約為39 kD,純化後的重組N-糖酰胺酶可以對變性處理的糖蛋白進行糖鏈的切除,且這種作用需要還原劑DTT的輔助作用;N-糖酰胺酶隻對錯誤摺疊的糖蛋白有作用,對天然的糖蛋白沒有作用.等量粟酒裂殖酵母Png1p在不同溫度、pH,DTT濃度和底物變性溫度下對等量覈糖覈痠酶B(RNase B)的脫糖基化檢測髮現,重組酶的最適反應溫度30℃,最適反應pH為7.0,需要的最適DTT濃度為10 mmol/L,底物在100℃處理10 min時酶的脫糖基化率最高.
근거GenBank중공포적속주렬식효모(Schizosaccharomyces pombe)N-당선알매(Png1p)cDNA서렬,설계병합성일대특이성인물,이용RT-PCR기술종속주렬식효모중극륭출당선알매cDNA.장득도적기인극륭도표체재체pET-15b중.중조질립전입대장간균BL21(DE3)중,경유도표체화순화제취후,진행매활측정.실험결과표명,해매적분자량약위39 kD,순화후적중조N-당선알매가이대변성처리적당단백진행당련적절제,차저충작용수요환원제DTT적보조작용;N-당선알매지대착오절첩적당단백유작용,대천연적당단백몰유작용.등량속주렬식효모Png1p재불동온도、pH,DTT농도화저물변성온도하대등량핵당핵산매B(RNase B)적탈당기화검측발현,중조매적최괄반응온도30℃,최괄반응pH위7.0,수요적최괄DTT농도위10 mmol/L,저물재100℃처리10 min시매적탈당기화솔최고.
