安徽医科大学学报
安徽醫科大學學報
안휘의과대학학보
ACTA UNIVERSITY MEDICINALIS ANHUI
2009年
1期
10-13
,共4页
汪云飞%朱恒锐%张庆慧%邢昕%武标%刘晓颖%范礼斌
汪雲飛%硃恆銳%張慶慧%邢昕%武標%劉曉穎%範禮斌
왕운비%주항예%장경혜%형흔%무표%류효영%범례빈
蛋白质类/遗传学%酵母菌/遗传学%双杂交系统技术%骨骺%脊柱/畸形
蛋白質類/遺傳學%酵母菌/遺傳學%雙雜交繫統技術%骨骺%脊柱/畸形
단백질류/유전학%효모균/유전학%쌍잡교계통기술%골후%척주/기형
目的 构建Sedlin的点突变体,研究其与PAM14在酵母中的相互作用,寻找其相互作用的位点.方法 用蛋白质在线序列分析软件CPHmodels预测Sedlin蛋白的磷酸化位点,可能的磷酸化位点主要有S2、S30、S119、S124、Y115,针对其中一个磷酸化位点(S124)设计定点突变引物;以pAS-Sedlin为模板,以两条含有突变位点的互补序列为引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物用Dpn Ⅰ酶切除去模板,消化产物转化大肠杆菌感受态DH5α,对得到的阳性克隆进行测序;将构建的定点突变质粒pAS-sedIins与pACT2-PAM14共转化至酵母Y190中,并对生长至合适大小的克隆进行B-半乳糖苷酶活性分析.结果 构建了pAS-Sedlin的定点突变质粒pAS-SedlinS,其与pACT2-PAM14共转克隆的β-半乳糖苷酶活性反应呈阳性,并且Sedlin S124A蛋白与PAM14蛋白的相互作用比野生型Sedlin蛋白与PAM14蛋白相互作用强.结论 成功构建了Sedlin S124A,Sedlin蛋白的S124并不是其与PAM14在酵母中相互作用的特异性结合位点.
目的 構建Sedlin的點突變體,研究其與PAM14在酵母中的相互作用,尋找其相互作用的位點.方法 用蛋白質在線序列分析軟件CPHmodels預測Sedlin蛋白的燐痠化位點,可能的燐痠化位點主要有S2、S30、S119、S124、Y115,針對其中一箇燐痠化位點(S124)設計定點突變引物;以pAS-Sedlin為模闆,以兩條含有突變位點的互補序列為引物進行PCR擴增,將得到的PCR產物用Dpn Ⅰ酶切除去模闆,消化產物轉化大腸桿菌感受態DH5α,對得到的暘性剋隆進行測序;將構建的定點突變質粒pAS-sedIins與pACT2-PAM14共轉化至酵母Y190中,併對生長至閤適大小的剋隆進行B-半乳糖苷酶活性分析.結果 構建瞭pAS-Sedlin的定點突變質粒pAS-SedlinS,其與pACT2-PAM14共轉剋隆的β-半乳糖苷酶活性反應呈暘性,併且Sedlin S124A蛋白與PAM14蛋白的相互作用比野生型Sedlin蛋白與PAM14蛋白相互作用彊.結論 成功構建瞭Sedlin S124A,Sedlin蛋白的S124併不是其與PAM14在酵母中相互作用的特異性結閤位點.
목적 구건Sedlin적점돌변체,연구기여PAM14재효모중적상호작용,심조기상호작용적위점.방법 용단백질재선서렬분석연건CPHmodels예측Sedlin단백적린산화위점,가능적린산화위점주요유S2、S30、S119、S124、Y115,침대기중일개린산화위점(S124)설계정점돌변인물;이pAS-Sedlin위모판,이량조함유돌변위점적호보서렬위인물진행PCR확증,장득도적PCR산물용Dpn Ⅰ매절제거모판,소화산물전화대장간균감수태DH5α,대득도적양성극륭진행측서;장구건적정점돌변질립pAS-sedIins여pACT2-PAM14공전화지효모Y190중,병대생장지합괄대소적극륭진행B-반유당감매활성분석.결과 구건료pAS-Sedlin적정점돌변질립pAS-SedlinS,기여pACT2-PAM14공전극륭적β-반유당감매활성반응정양성,병차Sedlin S124A단백여PAM14단백적상호작용비야생형Sedlin단백여PAM14단백상호작용강.결론 성공구건료Sedlin S124A,Sedlin단백적S124병불시기여PAM14재효모중상호작용적특이성결합위점.
