畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2011年
4期
527-532
,共6页
吴锦艳%田宏%郑海学%陈妍%靳野%尚佑军%刘湘涛
吳錦豔%田宏%鄭海學%陳妍%靳野%尚祐軍%劉湘濤
오금염%전굉%정해학%진연%근야%상우군%류상도
T7RNA聚合酶基因%逆转录病毒载体%PK15细胞%SK6细胞%稳定表达
T7RNA聚閤酶基因%逆轉錄病毒載體%PK15細胞%SK6細胞%穩定錶達
T7RNA취합매기인%역전록병독재체%PK15세포%SK6세포%은정표체
本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析.作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7.将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆.对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性.用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性.结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱.免疫荧光检测发现所表达的T7 RNAP蛋白具有良好的反应原性.本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具.
本研究旨在利用逆轉錄病毒載體繫統將T7RNA聚閤酶基因導入豬源細胞,併對該基因的遺傳穩定性進行分析.作者剋隆併構建含T7RNA聚閤酶基因的逆轉錄病毒重組載體pBABEpuro/T7.將pBABEpuro/T7與水泡性口炎病毒載體pVSV-G共轉染GP2-293細胞,收穫重組病毒併用該病毒在Polybrene的介導下分彆感染PK15和SK6細胞,用嘌呤黴素篩選暘性細胞剋隆.對此暘性細胞進行傳代,併對不同代次細胞中的T7RNA聚閤酶基因進行擴增,確定其遺傳穩定性.用直接熒光法和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測細胞中T7RNA聚閤酶基因的錶達及其活性.結果錶明T7RNA聚閤酶能夠被穩定地整閤進靶細胞基因組內,細胞繫內的T7RNA聚閤酶具有較好的轉錄活性,其活性傳代不減弱.免疫熒光檢測髮現所錶達的T7 RNAP蛋白具有良好的反應原性.本研究錶明T7RNA聚閤酶基因穩定整閤進豬源細胞,該基因的穩定整閤為建立高效體內病毒拯救繫統提供瞭良好的工具.
본연구지재이용역전록병독재체계통장T7RNA취합매기인도입저원세포,병대해기인적유전은정성진행분석.작자극륭병구건함T7RNA취합매기인적역전록병독중조재체pBABEpuro/T7.장pBABEpuro/T7여수포성구염병독재체pVSV-G공전염GP2-293세포,수획중조병독병용해병독재Polybrene적개도하분별감염PK15화SK6세포,용표령매소사선양성세포극륭.대차양성세포진행전대,병대불동대차세포중적T7RNA취합매기인진행확증,학정기유전은정성.용직접형광법화취병희선알응효전영검측세포중T7RNA취합매기인적표체급기활성.결과표명T7RNA취합매능구피은정지정합진파세포기인조내,세포계내적T7RNA취합매구유교호적전록활성,기활성전대불감약.면역형광검측발현소표체적T7 RNAP단백구유량호적반응원성.본연구표명T7RNA취합매기인은정정합진저원세포,해기인적은정정합위건립고효체내병독증구계통제공료량호적공구.
