CAJ | 학술논문

目的: 采用蛋白质工程技术将a B晶状体蛋白(a B-crystallin,a BC)导入心肌细胞,以深入研究其保护心肌缺血损伤的分子机理,并为将其应用于防治心肌缺血损伤奠定基础.方法: 将人a BC的全长cDNA基因克隆至具有细胞膜通透能力的膜移位序列(membrane-translocat ing sequence,MTS)的下游,构建含GST-MTS-a BC融合蛋白基因的原核表达质粒,转染大肠杆菌DH5a.经IPTG诱导表达后,裂解细菌,谷胱甘肽亲和层析分离纯化GST-MTS-a BC融合蛋白,采用Xa因子切除GST,纤维素-DEAE-52离子交换层析分离纯化MTS-a BC.在检测其分子伴娘活性的基础上,采用异硫氰荧光索(FITC)对MTS-a BC进行标记,加入新生大鼠心肌细胞培养基中,采用荧光显微镜观察其在心肌细胞中的分布.结果: 1.重组的GST-MST-a BC质粒经EcoRI酶切后,可见一4.9 kb的载体及690 bp的a BC基因插入片段 . 经测序证实,重组质粒中的GST-MTS-a BC融合蛋白的序列处于同一阅读框架.2.GST-MTS-a BC原核表达质粒导入DH5a,阳性克隆经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示50 kD的GST-MTS-a BC诱导表达带.用谷胱甘肽亲和层析能分离该诱导表达组分.分离的GST-MTS-a BC被Xa因子切成二段,其一为23 kD的MTS-a BC:另一为26 kD的GST.Western免疫印迹分析证实,GST-MTS- a BC及MTS-a BC均能为人a BC抗体识别.3.MTS-a BC能使变性聚集的肌动蛋白重新解聚,其分子伴娘功能与HSP25大小相当. F ITC标记的MTS-a BC能进入心肌细胞中,而同样标记的a BC及牛血清白蛋白(BSA)均不能进入细胞.讨论: 本研究将12个氨基酸残基组成的具有膜通透能力的MTS的碱基顺序与a BC的全长cD NA序列融合,在大肠杆菌中表达出了MTS-a BC.这种融合蛋白不但具有a BC的分子伴娘功能 , 而且能导入心肌细胞.结论: 1.克隆、表达并纯化了具有分子伴娘活性的MTS-a BC.借助MT S的介导作用,能将a BC导入心肌细跑.2. a BC导入心肌细胞的成功,为进一步研究其保护心肌缺血损伤的分子机理提供了研究工具,并为将其应用于防治心肌缺血损伤奠定了基础. 目的: 採用蛋白質工程技術將a B晶狀體蛋白(a B-crystallin,a BC)導入心肌細胞,以深入研究其保護心肌缺血損傷的分子機理,併為將其應用于防治心肌缺血損傷奠定基礎.方法: 將人a BC的全長cDNA基因剋隆至具有細胞膜通透能力的膜移位序列(membrane-translocat ing sequence,MTS)的下遊,構建含GST-MTS-a BC融閤蛋白基因的原覈錶達質粒,轉染大腸桿菌DH5a.經IPTG誘導錶達後,裂解細菌,穀胱甘肽親和層析分離純化GST-MTS-a BC融閤蛋白,採用Xa因子切除GST,纖維素-DEAE-52離子交換層析分離純化MTS-a BC.在檢測其分子伴孃活性的基礎上,採用異硫氰熒光索(FITC)對MTS-a BC進行標記,加入新生大鼠心肌細胞培養基中,採用熒光顯微鏡觀察其在心肌細胞中的分佈.結果: 1.重組的GST-MST-a BC質粒經EcoRI酶切後,可見一4.9 kb的載體及690 bp的a BC基因插入片段 . 經測序證實,重組質粒中的GST-MTS-a BC融閤蛋白的序列處于同一閱讀框架.2.GST-MTS-a BC原覈錶達質粒導入DH5a,暘性剋隆經IPTG誘導後,SDS-PAGE顯示50 kD的GST-MTS-a BC誘導錶達帶.用穀胱甘肽親和層析能分離該誘導錶達組分.分離的GST-MTS-a BC被Xa因子切成二段,其一為23 kD的MTS-a BC:另一為26 kD的GST.Western免疫印跡分析證實,GST-MTS- a BC及MTS-a BC均能為人a BC抗體識彆.3.MTS-a BC能使變性聚集的肌動蛋白重新解聚,其分子伴孃功能與HSP25大小相噹. F ITC標記的MTS-a BC能進入心肌細胞中,而同樣標記的a BC及牛血清白蛋白(BSA)均不能進入細胞.討論: 本研究將12箇氨基痠殘基組成的具有膜通透能力的MTS的堿基順序與a BC的全長cD NA序列融閤,在大腸桿菌中錶達齣瞭MTS-a BC.這種融閤蛋白不但具有a BC的分子伴孃功能 , 而且能導入心肌細胞.結論: 1.剋隆、錶達併純化瞭具有分子伴孃活性的MTS-a BC.藉助MT S的介導作用,能將a BC導入心肌細跑.2. a BC導入心肌細胞的成功,為進一步研究其保護心肌缺血損傷的分子機理提供瞭研究工具,併為將其應用于防治心肌缺血損傷奠定瞭基礎.
목적: 채용단백질공정기술장a B정상체단백(a B-crystallin,a BC)도입심기세포,이심입연구기보호심기결혈손상적분자궤리,병위장기응용우방치심기결혈손상전정기출.방법: 장인a BC적전장cDNA기인극륭지구유세포막통투능력적막이위서렬(membrane-translocat ing sequence,MTS)적하유,구건함GST-MTS-a BC융합단백기인적원핵표체질립,전염대장간균DH5a.경IPTG유도표체후,렬해세균,곡광감태친화층석분리순화GST-MTS-a BC융합단백,채용Xa인자절제GST,섬유소-DEAE-52리자교환층석분리순화MTS-a BC.재검측기분자반낭활성적기출상,채용이류청형광색(FITC)대MTS-a BC진행표기,가입신생대서심기세포배양기중,채용형광현미경관찰기재심기세포중적분포.결과: 1.중조적GST-MST-a BC질립경EcoRI매절후,가견일4.9 kb적재체급690 bp적a BC기인삽입편단 . 경측서증실,중조질립중적GST-MTS-a BC융합단백적서렬처우동일열독광가.2.GST-MTS-a BC원핵표체질립도입DH5a,양성극륭경IPTG유도후,SDS-PAGE현시50 kD적GST-MTS-a BC유도표체대.용곡광감태친화층석능분리해유도표체조분.분리적GST-MTS-a BC피Xa인자절성이단,기일위23 kD적MTS-a BC:령일위26 kD적GST.Western면역인적분석증실,GST-MTS- a BC급MTS-a BC균능위인a BC항체식별.3.MTS-a BC능사변성취집적기동단백중신해취,기분자반낭공능여HSP25대소상당. F ITC표기적MTS-a BC능진입심기세포중,이동양표기적a BC급우혈청백단백(BSA)균불능진입세포.토론: 본연구장12개안기산잔기조성적구유막통투능력적MTS적감기순서여a BC적전장cD NA서렬융합,재대장간균중표체출료MTS-a BC.저충융합단백불단구유a BC적분자반낭공능 , 이차능도입심기세포.결론: 1.극륭、표체병순화료구유분자반낭활성적MTS-a BC.차조MT S적개도작용,능장a BC도입심기세포.2. a BC도입심기세포적성공,위진일보연구기보호심기결혈손상적분자궤리제공료연구공구,병위장기응용우방치심기결혈손상전정료기출.