中国老年学杂志
中國老年學雜誌
중국노년학잡지
CHINESE JOURNAL OF GERONTOLOGY
2010年
5期
635-638
,共4页
王飞%朱庆三%苗旭漫%胡宁宁%李霄%金宁一
王飛%硃慶三%苗旭漫%鬍寧寧%李霄%金寧一
왕비%주경삼%묘욱만%호저저%리소%금저일
衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)%表达%纯化%生物学功能
衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)%錶達%純化%生物學功能
의원체단백매양활성인자(CPAF)%표체%순화%생물학공능
目的 构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体,经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白,研究其生物学功能.方法 从病料中克隆得到CPAF的原始基因,将PCR产物经纯化连接到pMD18-T,将重组质粒pMD-CPAF经NdeI和BamHI双酶切,与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接,建立pET42b(+)-CPAF表达载体,阳性克隆经鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白,进行SDS-PAGE分析,Western印迹检测.结果 经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确.SDS-PAGE和Western印迹结果显示在70 kD处呈现单一蛋白条带,pET42b(+)-CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了CPAF天然蛋白,目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右,采用镍柱的亲和纯化后,可达70%左右.结论 经DNA测序、SDS-PAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株,并获得纯化CPAF的方法,为今后CPAF的研究及应用奠定了基础.
目的 構建含衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)的原覈錶達載體,經轉化E.coli以錶達CPAF融閤蛋白,研究其生物學功能.方法 從病料中剋隆得到CPAF的原始基因,將PCR產物經純化連接到pMD18-T,將重組質粒pMD-CPAF經NdeI和BamHI雙酶切,與用相同酶消化的原覈錶達載體pET42b(+)連接,建立pET42b(+)-CPAF錶達載體,暘性剋隆經鑒定後,轉化大腸桿菌BL21(DE3)進行錶達,經親和純化、離子交換純化、分子篩純化融閤蛋白,進行SDS-PAGE分析,Western印跡檢測.結果 經酶切鑒定和測序分析證實原覈錶達質粒構建正確.SDS-PAGE和Western印跡結果顯示在70 kD處呈現單一蛋白條帶,pET42b(+)-CPAF重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)中成功地錶達瞭CPAF天然蛋白,目的蛋白佔全菌體蛋白的20%左右,採用鎳柱的親和純化後,可達70%左右.結論 經DNA測序、SDS-PAGE、Western印跡檢測錶明成功構建瞭能夠穩定錶達可溶性CPAF的菌株,併穫得純化CPAF的方法,為今後CPAF的研究及應用奠定瞭基礎.
목적 구건함의원체단백매양활성인자(CPAF)적원핵표체재체,경전화E.coli이표체CPAF융합단백,연구기생물학공능.방법 종병료중극륭득도CPAF적원시기인,장PCR산물경순화련접도pMD18-T,장중조질립pMD-CPAF경NdeI화BamHI쌍매절,여용상동매소화적원핵표체재체pET42b(+)련접,건립pET42b(+)-CPAF표체재체,양성극륭경감정후,전화대장간균BL21(DE3)진행표체,경친화순화、리자교환순화、분자사순화융합단백,진행SDS-PAGE분석,Western인적검측.결과 경매절감정화측서분석증실원핵표체질립구건정학.SDS-PAGE화Western인적결과현시재70 kD처정현단일단백조대,pET42b(+)-CPAF중조재체재대장간균BL21(DE3)중성공지표체료CPAF천연단백,목적단백점전균체단백적20%좌우,채용얼주적친화순화후,가체70%좌우.결론 경DNA측서、SDS-PAGE、Western인적검측표명성공구건료능구은정표체가용성CPAF적균주,병획득순화CPAF적방법,위금후CPAF적연구급응용전정료기출.
