生物技术通报
生物技術通報
생물기술통보
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011年
11期
107-117
,共11页
梁伟%肖红%高笑宇%杜晓媛%汪慧%郭旭东%刘东军
樑偉%肖紅%高笑宇%杜曉媛%汪慧%郭旭東%劉東軍
량위%초홍%고소우%두효원%왕혜%곽욱동%류동군
KGF%表达载体%胚胎干细胞%毛囊%UHS%红色荧光蛋白%脂质体转染%悬浮法
KGF%錶達載體%胚胎榦細胞%毛囊%UHS%紅色熒光蛋白%脂質體轉染%懸浮法
KGF%표체재체%배태간세포%모낭%UHS%홍색형광단백%지질체전염%현부법
旨在构建小鼠角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体pCDsR-UKA,通过脂质体转染法转染小鼠胚胎干细胞( mESC),并进一步优化其转染条件,最终获得可以正常生长并稳定表达红色荧光蛋白的转KGF基因的ES细胞.利用RTPCR技术扩增小鼠KGF基因cDNA并构建表达载体pCDsR-UKA (6.6 kb),经鉴定正确的重组质粒DNA用脂质体包裹后转染mESC.从小鼠成纤维细胞cDNA扩增出891 bp的KGF基因片段与UHS启动子和BGH polyA序列成功重组到pCDsRed2载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为KGF基因且方向正确.采用脂质体法优化转染条件,mESC最高转染效率达到(34.4±4.1)％.经G418筛选的转基因ES细胞通过PCR鉴定证实外源基因已整合在ES细胞基因组中.成功获得了小鼠KGF基因片段,以及真核表达载体pCDsR-UKA,经优化的脂质体悬浮法转染条件,在六孔板中当DNA与脂质体比例为3:10时,可获得最佳转染效率且不改变ES细胞的生长状态,经筛选获得了转基因ES细胞克隆.为下一步通过四倍体补偿技术获得ES小鼠提供了转基因ES细胞.
旨在構建小鼠角質細胞生長因子(KGF)真覈錶達載體pCDsR-UKA,通過脂質體轉染法轉染小鼠胚胎榦細胞( mESC),併進一步優化其轉染條件,最終穫得可以正常生長併穩定錶達紅色熒光蛋白的轉KGF基因的ES細胞.利用RTPCR技術擴增小鼠KGF基因cDNA併構建錶達載體pCDsR-UKA (6.6 kb),經鑒定正確的重組質粒DNA用脂質體包裹後轉染mESC.從小鼠成纖維細胞cDNA擴增齣891 bp的KGF基因片段與UHS啟動子和BGH polyA序列成功重組到pCDsRed2載體中.經酶切和DNA測序驗證,插入載體的DNA片段為KGF基因且方嚮正確.採用脂質體法優化轉染條件,mESC最高轉染效率達到(34.4±4.1)％.經G418篩選的轉基因ES細胞通過PCR鑒定證實外源基因已整閤在ES細胞基因組中.成功穫得瞭小鼠KGF基因片段,以及真覈錶達載體pCDsR-UKA,經優化的脂質體懸浮法轉染條件,在六孔闆中噹DNA與脂質體比例為3:10時,可穫得最佳轉染效率且不改變ES細胞的生長狀態,經篩選穫得瞭轉基因ES細胞剋隆.為下一步通過四倍體補償技術穫得ES小鼠提供瞭轉基因ES細胞.
지재구건소서각질세포생장인자(KGF)진핵표체재체pCDsR-UKA,통과지질체전염법전염소서배태간세포( mESC),병진일보우화기전염조건,최종획득가이정상생장병은정표체홍색형광단백적전KGF기인적ES세포.이용RTPCR기술확증소서KGF기인cDNA병구건표체재체pCDsR-UKA (6.6 kb),경감정정학적중조질립DNA용지질체포과후전염mESC.종소서성섬유세포cDNA확증출891 bp적KGF기인편단여UHS계동자화BGH polyA서렬성공중조도pCDsRed2재체중.경매절화DNA측서험증,삽입재체적DNA편단위KGF기인차방향정학.채용지질체법우화전염조건,mESC최고전염효솔체도(34.4±4.1)％.경G418사선적전기인ES세포통과PCR감정증실외원기인이정합재ES세포기인조중.성공획득료소서KGF기인편단,이급진핵표체재체pCDsR-UKA,경우화적지질체현부법전염조건,재륙공판중당DNA여지질체비례위3:10시,가획득최가전염효솔차불개변ES세포적생장상태,경사선획득료전기인ES세포극륭.위하일보통과사배체보상기술획득ES소서제공료전기인ES세포.
