军事医学科学院院刊
軍事醫學科學院院刊
군사의학과학원원간
BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES
2008年
4期
316-318
,共3页
高翔%包士中%史晶%蔡昆%刘昊%侯晓军%王慧
高翔%包士中%史晶%蔡昆%劉昊%侯曉軍%王慧
고상%포사중%사정%채곤%류호%후효군%왕혜
肠出血性大肠杆菌%紧密黏附素%免疫原性
腸齣血性大腸桿菌%緊密黏附素%免疫原性
장출혈성대장간균%긴밀점부소%면역원성
目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b(+).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b(+)-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.
目的:在基因工程菌中實現腸齣血性大腸桿菌(EHEC)O157∶ H7緊密黏附素(intimin)保護性片段(Int281)的高效錶達,併進行抗原性的初步分析.方法:應用PCR從EHEC O157∶ H7基因組中釣取int281基因,插入pMD18-T剋隆載體.剋隆質粒測序鑒定後,採用NdeⅠ、NotⅠ限製性覈痠內切酶雙酶切pMD18-T-int281質粒穫得int281基因,連接同樣經過雙酶切的pET-22b(+).錶達質粒測序鑒定後轉化E.coli BL21(DE3),IPTG誘導錶達,經SDS-PAGE檢測相對分子質量和Western 印跡驗證免疫學活性後,重組Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA檢測鼠血清抗體效價.結果:PCR擴增得到843 bp的目的片段.構建的原覈錶達質粒pET-22b(+)-int281經酶切鑒定及測序與預期序列一緻.目的蛋白以包涵體形式錶達,錶達量約25%.變性複性後經鎳柱純化後純度達95%以上.免疫印跡檢測顯示,重組Int281片段可以特異性地識彆抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗體效價達1∶ 106.結論:重組Int281具有良好的免疫原性,為製備相應的抗體及研究其對EHEC O157∶ H7黏附定植的被動保護效果奠定瞭基礎.
목적:재기인공정균중실현장출혈성대장간균(EHEC)O157∶ H7긴밀점부소(intimin)보호성편단(Int281)적고효표체,병진행항원성적초보분석.방법:응용PCR종EHEC O157∶ H7기인조중조취int281기인,삽입pMD18-T극륭재체.극륭질립측서감정후,채용NdeⅠ、NotⅠ한제성핵산내절매쌍매절pMD18-T-int281질립획득int281기인,련접동양경과쌍매절적pET-22b(+).표체질립측서감정후전화E.coli BL21(DE3),IPTG유도표체,경SDS-PAGE검측상대분자질량화Western 인적험증면역학활성후,중조Int281단백면역BALB/c소서,ELISA검측서혈청항체효개.결과:PCR확증득도843 bp적목적편단.구건적원핵표체질립pET-22b(+)-int281경매절감정급측서여예기서렬일치.목적단백이포함체형식표체,표체량약25%.변성복성후경얼주순화후순도체95%이상.면역인적검측현시,중조Int281편단가이특이성지식별항O157∶ H7다항.면역소서항체효개체1∶ 106.결론:중조Int281구유량호적면역원성,위제비상응적항체급연구기대EHEC O157∶ H7점부정식적피동보호효과전정료기출.
