第三军医大学学报
第三軍醫大學學報
제삼군의대학학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE
2001年
12期
1386-1389
,共4页
王明海%太光平%张雅萍%肖光夏
王明海%太光平%張雅萍%肖光夏
왕명해%태광평%장아평%초광하
IκBα基因%SAA3启动子%NF-κB%腺病毒%巨噬细胞%TNF-α%IL-6
IκBα基因%SAA3啟動子%NF-κB%腺病毒%巨噬細胞%TNF-α%IL-6
IκBα기인%SAA3계동자%NF-κB%선병독%거서세포%TNF-α%IL-6
目的通过构建IκBα基因的腺病毒表达载体,并用急性相反应蛋白SAA3启动子来指导目的基因IκBα的表达,体外观察在炎性刺激后IκBα蛋白的诱导性表达特性及对NF-κB活性的调控作用,对炎症介质产生的抑制效应. 方法采用DNA重组与同源重组技术,构建含只响应病理信号的启动子-急性相反应蛋白启动子SAA3、目的基因IκBα的炎症诱导性复制缺陷型重组腺病毒载体(AdIκBα).应用AdIκBα,选择在炎症反应中具有代表意义的巨噬细胞,观察AdIκBα在体外培养巨噬细胞U937中诱导性表达IκBα (Western blot)、对NF-κB活性的调控(EMSA)及体外效应.结果①成功构建炎症诱导性IκBα表达质粒(pAdpLpl SAA3 NLS IκBα),该表达框含SAA3启动子,SV40大T抗原核定位信号(NLS),IκBα cDNA和ploy A; ② pAdpLpL SAA3 NLS IκBα质粒与pJM17同源重组,脂质体(DOTAP)介导,共转染入293细胞.PCR法筛选阳性克隆,获得重组腺病毒(Ad IκBα); ③用293细胞扩增Ad IκBα;采用反复冻融法纯化腺病毒,获得高滴度(5×1010 pfu/ml)重组腺病毒; ④体外实验,用50 MOI Ad IκBα预感染体外培养的U937细胞,再用LPS攻击后,该腺病毒诱导性表达IκBα蛋白(Western blot),且表达的IκBα能抑制NF-κB的活化(EMSA)、下调LPS攻击后TNF-α、IL-6的产生.结论该IκBα腺病毒表达载体通过调控NF-κB活性,可调控炎症介质(TNF-α、IL-6)的产生,用于调理细胞的炎症反应.
目的通過構建IκBα基因的腺病毒錶達載體,併用急性相反應蛋白SAA3啟動子來指導目的基因IκBα的錶達,體外觀察在炎性刺激後IκBα蛋白的誘導性錶達特性及對NF-κB活性的調控作用,對炎癥介質產生的抑製效應. 方法採用DNA重組與同源重組技術,構建含隻響應病理信號的啟動子-急性相反應蛋白啟動子SAA3、目的基因IκBα的炎癥誘導性複製缺陷型重組腺病毒載體(AdIκBα).應用AdIκBα,選擇在炎癥反應中具有代錶意義的巨噬細胞,觀察AdIκBα在體外培養巨噬細胞U937中誘導性錶達IκBα (Western blot)、對NF-κB活性的調控(EMSA)及體外效應.結果①成功構建炎癥誘導性IκBα錶達質粒(pAdpLpl SAA3 NLS IκBα),該錶達框含SAA3啟動子,SV40大T抗原覈定位信號(NLS),IκBα cDNA和ploy A; ② pAdpLpL SAA3 NLS IκBα質粒與pJM17同源重組,脂質體(DOTAP)介導,共轉染入293細胞.PCR法篩選暘性剋隆,穫得重組腺病毒(Ad IκBα); ③用293細胞擴增Ad IκBα;採用反複凍融法純化腺病毒,穫得高滴度(5×1010 pfu/ml)重組腺病毒; ④體外實驗,用50 MOI Ad IκBα預感染體外培養的U937細胞,再用LPS攻擊後,該腺病毒誘導性錶達IκBα蛋白(Western blot),且錶達的IκBα能抑製NF-κB的活化(EMSA)、下調LPS攻擊後TNF-α、IL-6的產生.結論該IκBα腺病毒錶達載體通過調控NF-κB活性,可調控炎癥介質(TNF-α、IL-6)的產生,用于調理細胞的炎癥反應.
목적통과구건IκBα기인적선병독표체재체,병용급성상반응단백SAA3계동자래지도목적기인IκBα적표체,체외관찰재염성자격후IκBα단백적유도성표체특성급대NF-κB활성적조공작용,대염증개질산생적억제효응. 방법채용DNA중조여동원중조기술,구건함지향응병리신호적계동자-급성상반응단백계동자SAA3、목적기인IκBα적염증유도성복제결함형중조선병독재체(AdIκBα).응용AdIκBα,선택재염증반응중구유대표의의적거서세포,관찰AdIκBα재체외배양거서세포U937중유도성표체IκBα (Western blot)、대NF-κB활성적조공(EMSA)급체외효응.결과①성공구건염증유도성IκBα표체질립(pAdpLpl SAA3 NLS IκBα),해표체광함SAA3계동자,SV40대T항원핵정위신호(NLS),IκBα cDNA화ploy A; ② pAdpLpL SAA3 NLS IκBα질립여pJM17동원중조,지질체(DOTAP)개도,공전염입293세포.PCR법사선양성극륭,획득중조선병독(Ad IκBα); ③용293세포확증Ad IκBα;채용반복동융법순화선병독,획득고적도(5×1010 pfu/ml)중조선병독; ④체외실험,용50 MOI Ad IκBα예감염체외배양적U937세포,재용LPS공격후,해선병독유도성표체IκBα단백(Western blot),차표체적IκBα능억제NF-κB적활화(EMSA)、하조LPS공격후TNF-α、IL-6적산생.결론해IκBα선병독표체재체통과조공NF-κB활성,가조공염증개질(TNF-α、IL-6)적산생,용우조리세포적염증반응.
