中国兽医学报
中國獸醫學報
중국수의학보
CHINESE JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE
2009年
5期
537-541
,共5页
夏平安%尹彦涛%李素平%党占国%王建举%王中明%李伟娟%崔保安
夏平安%尹彥濤%李素平%黨佔國%王建舉%王中明%李偉娟%崔保安
하평안%윤언도%리소평%당점국%왕건거%왕중명%리위연%최보안
PRRSV%N蛋白%原核表达%ELISA
PRRSV%N蛋白%原覈錶達%ELISA
PRRSV%N단백%원핵표체%ELISA
根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 美洲株 ATCC VR2332 的 N 蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从PRRSV Hn-1/06株中克隆了大小为372 bp的 N 蛋白基因(EU025136).将 N 蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-N,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为33 000的可溶性融合蛋白N-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的29%.将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300 mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达,91%.用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性.利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗PRRSV N 蛋白抗体的间接ELISA方法(N-ELISA),并将所建立的N-ELISA与国外进口的PRRS检测试剂盒IDEXX-ELISA对200份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为92.7%.结果表明,本试验建立的N-ELISA与IDEXX-ELISA具有同样高的特异性.
根據GenBank中豬繁殖與呼吸綜閤徵病毒(PRRSV) 美洲株 ATCC VR2332 的 N 蛋白基因序列,設計閤成1對特異性引物,用RT-PCR方法從PRRSV Hn-1/06株中剋隆瞭大小為372 bp的 N 蛋白基因(EU025136).將 N 蛋白基因亞剋隆到原覈錶達載體pET-32a中構建瞭重組錶達質粒pET-N,在IPTG的誘導下成功錶達瞭相對分子質量約為33 000的可溶性融閤蛋白N-His;經SDS-PAGE和凝膠薄層掃描分析,融閤蛋白的錶達量約佔細菌總蛋白量的29%.將融閤蛋白加入鎳瓊脂糖凝膠樹脂層析柱,經300 mmol/L咪唑燐痠鹽緩遲液洗脫,其純度可達,91%.用Western blotting分析純化後的融閤蛋白,顯示良好的生物學活性.利用純化融閤蛋白作包被抗原及優化ELISA反應條件,建立瞭可檢測抗PRRSV N 蛋白抗體的間接ELISA方法(N-ELISA),併將所建立的N-ELISA與國外進口的PRRS檢測試劑盒IDEXX-ELISA對200份臨床送檢血清進行平行檢測,暘性符閤率為92.7%.結果錶明,本試驗建立的N-ELISA與IDEXX-ELISA具有同樣高的特異性.
근거GenBank중저번식여호흡종합정병독(PRRSV) 미주주 ATCC VR2332 적 N 단백기인서렬,설계합성1대특이성인물,용RT-PCR방법종PRRSV Hn-1/06주중극륭료대소위372 bp적 N 단백기인(EU025136).장 N 단백기인아극륭도원핵표체재체pET-32a중구건료중조표체질립pET-N,재IPTG적유도하성공표체료상대분자질량약위33 000적가용성융합단백N-His;경SDS-PAGE화응효박층소묘분석,융합단백적표체량약점세균총단백량적29%.장융합단백가입얼경지당응효수지층석주,경300 mmol/L미서린산염완충액세탈,기순도가체,91%.용Western blotting분석순화후적융합단백,현시량호적생물학활성.이용순화융합단백작포피항원급우화ELISA반응조건,건립료가검측항PRRSV N 단백항체적간접ELISA방법(N-ELISA),병장소건립적N-ELISA여국외진구적PRRS검측시제합IDEXX-ELISA대200빈림상송검혈청진행평행검측,양성부합솔위92.7%.결과표명,본시험건립적N-ELISA여IDEXX-ELISA구유동양고적특이성.
