中国医药生物技术
中國醫藥生物技術
중국의약생물기술
CHINESE MEDICINAL BIOTECHNOLOGY
2008年
1期
30-35
,共6页
周新刚%杨华%段开红%唐宇龙%马占忠%胡忠义
週新剛%楊華%段開紅%唐宇龍%馬佔忠%鬍忠義
주신강%양화%단개홍%당우룡%마점충%호충의
分枝杆菌,结核%重组融合蛋白质类%表位%细菌噬菌体M13%肽库
分枝桿菌,結覈%重組融閤蛋白質類%錶位%細菌噬菌體M13%肽庫
분지간균,결핵%중조융합단백질류%표위%세균서균체M13%태고
目的 探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白 10(CFP-10)/早期分泌抗原靶点 6(ESAT-6)融合蛋白 (CE 融合蛋白) 模拟抗原表位筛选中的应用.方法 以抗 CE 融合蛋白多克隆抗体为靶分子,对随机噬菌体 7 肽库进行筛选,经 3 轮生物淘选后,随机选取 18 个单噬菌体进行测序分析.采用双抗体夹心和竞争 ELISA 方法 对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定.采用间接ELISA 方法 ,选取阳性单噬菌体与 CE 融合蛋白分别对20 份活动性肺结核患者和 10 份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测.结果 经过 3 轮生物淘选,能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集.18 个单噬菌体测序共获得 9 种序列,其中单噬菌体 5、6、18 的氨基酸序列均包含 Trp-Asp-Ala-Thr (WDAT) 保守序列,该序列与 ESAT-6 第 58-61 位氨基酸的序列一致.9 种序列中各取 1 个单噬菌体经双抗体夹心和竞争 ELISA 检测,有 7 个单噬菌体 (1、5、6、10、13、14、18,S/N 值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0)确定为具有免疫活性的阳性克隆.选取含有 WDAT保守序列的阳性单噬菌体 5 与 CE 融合蛋白分别对 2 种血清标本抗体进行间接 ELISA 检测结果 显示,单噬菌体5 对 2 种血清标本抗体检测的吸光度值均高于 CE 融合蛋白(分别为0.931±0.298 vs 0.317±0.157、0.496±0.073vs 0.118±0.026,均P＜0.05);单噬菌体 5 对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率 (95%,19/20) 明显高于 CE融合蛋白 (60%,12/20),而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率 (9/10) 低于 CE 融合蛋白 (10/10).结论 利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出 7 个 CE融合蛋白的模拟抗原表位,并获得了定位于 ESAT-6 第 58～61 位氨基酸序列的 CE 融合蛋白的 1 个线性 B 细胞抗原表位,提高了 ELISA 检测的敏感性,为进一步研究 CE融合蛋白的其他抗原表位及以特异性抗原表位为基础开发结核抗体检测试剂奠定了基础.
目的 探討噬菌體展示隨機肽庫技術在結覈分枝桿菌培養濾過蛋白 10(CFP-10)/早期分泌抗原靶點 6(ESAT-6)融閤蛋白 (CE 融閤蛋白) 模擬抗原錶位篩選中的應用.方法 以抗 CE 融閤蛋白多剋隆抗體為靶分子,對隨機噬菌體 7 肽庫進行篩選,經 3 輪生物淘選後,隨機選取 18 箇單噬菌體進行測序分析.採用雙抗體夾心和競爭 ELISA 方法 對測序後噬菌體進行暘性剋隆及其活性鑒定.採用間接ELISA 方法 ,選取暘性單噬菌體與 CE 融閤蛋白分彆對20 份活動性肺結覈患者和 10 份有卡介苗接種史健康人的血清標本抗體進行檢測.結果 經過 3 輪生物淘選,能與靶分子特異性結閤的噬菌體得到瞭明顯富集.18 箇單噬菌體測序共穫得 9 種序列,其中單噬菌體 5、6、18 的氨基痠序列均包含 Trp-Asp-Ala-Thr (WDAT) 保守序列,該序列與 ESAT-6 第 58-61 位氨基痠的序列一緻.9 種序列中各取 1 箇單噬菌體經雙抗體夾心和競爭 ELISA 檢測,有 7 箇單噬菌體 (1、5、6、10、13、14、18,S/N 值依次為9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0)確定為具有免疫活性的暘性剋隆.選取含有 WDAT保守序列的暘性單噬菌體 5 與 CE 融閤蛋白分彆對 2 種血清標本抗體進行間接 ELISA 檢測結果 顯示,單噬菌體5 對 2 種血清標本抗體檢測的吸光度值均高于 CE 融閤蛋白(分彆為0.931±0.298 vs 0.317±0.157、0.496±0.073vs 0.118±0.026,均P＜0.05);單噬菌體 5 對活動性肺結覈患者血清標本抗體的檢齣率 (95%,19/20) 明顯高于 CE融閤蛋白 (60%,12/20),而對有卡介苗接種史健康人血清標本抗體的檢齣率 (9/10) 低于 CE 融閤蛋白 (10/10).結論 利用噬菌體展示隨機肽庫技術成功篩選齣 7 箇 CE融閤蛋白的模擬抗原錶位,併穫得瞭定位于 ESAT-6 第 58～61 位氨基痠序列的 CE 融閤蛋白的 1 箇線性 B 細胞抗原錶位,提高瞭 ELISA 檢測的敏感性,為進一步研究 CE融閤蛋白的其他抗原錶位及以特異性抗原錶位為基礎開髮結覈抗體檢測試劑奠定瞭基礎.
목적 탐토서균체전시수궤태고기술재결핵분지간균배양려과단백 10(CFP-10)/조기분비항원파점 6(ESAT-6)융합단백 (CE 융합단백) 모의항원표위사선중적응용.방법 이항 CE 융합단백다극륭항체위파분자,대수궤서균체 7 태고진행사선,경 3 륜생물도선후,수궤선취 18 개단서균체진행측서분석.채용쌍항체협심화경쟁 ELISA 방법 대측서후서균체진행양성극륭급기활성감정.채용간접ELISA 방법 ,선취양성단서균체여 CE 융합단백분별대20 빈활동성폐결핵환자화 10 빈유잡개묘접충사건강인적혈청표본항체진행검측.결과 경과 3 륜생물도선,능여파분자특이성결합적서균체득도료명현부집.18 개단서균체측서공획득 9 충서렬,기중단서균체 5、6、18 적안기산서렬균포함 Trp-Asp-Ala-Thr (WDAT) 보수서렬,해서렬여 ESAT-6 제 58-61 위안기산적서렬일치.9 충서렬중각취 1 개단서균체경쌍항체협심화경쟁 ELISA 검측,유 7 개단서균체 (1、5、6、10、13、14、18,S/N 치의차위9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0)학정위구유면역활성적양성극륭.선취함유 WDAT보수서렬적양성단서균체 5 여 CE 융합단백분별대 2 충혈청표본항체진행간접 ELISA 검측결과 현시,단서균체5 대 2 충혈청표본항체검측적흡광도치균고우 CE 융합단백(분별위0.931±0.298 vs 0.317±0.157、0.496±0.073vs 0.118±0.026,균P＜0.05);단서균체 5 대활동성폐결핵환자혈청표본항체적검출솔 (95%,19/20) 명현고우 CE융합단백 (60%,12/20),이대유잡개묘접충사건강인혈청표본항체적검출솔 (9/10) 저우 CE 융합단백 (10/10).결론 이용서균체전시수궤태고기술성공사선출 7 개 CE융합단백적모의항원표위,병획득료정위우 ESAT-6 제 58～61 위안기산서렬적 CE 융합단백적 1 개선성 B 세포항원표위,제고료 ELISA 검측적민감성,위진일보연구 CE융합단백적기타항원표위급이특이성항원표위위기출개발결핵항체검측시제전정료기출.
