CAJ | 학술논문

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台.
위구건고치병성저번식여호흡종합정병독(PRRSV)감염성극륭,본실험근거PRRSV HuN4주기인조서렬설계병합성PRRSV특이성인물,응용RT-PCR기술분6단확증료PRRSV HuN4주전기인조cDNA.장확증적각개cDNA부분중첩편단분별극륭우pBlueScript Ⅱ SK(+)재체중구건료감염성중조질립pHuN4.병재병독cDNA 5′말단인입sp6계동자서렬편우후기적체외전록획득병독적전록본,재3'말단Poly (A)미인입Not Ⅰ매절위점용우선성화pHuN4;차외,장HuN4기인조제14680위적A침묵돌변위G산생일개Mlu Ⅰ매절위점작위감정증구병독적분자표기.pHuN4통과매절선성화후경체외전록급전염BHK세포,병재Marc-145세포중구획병독.결과현시:구획적병독능구재Marc145세포인기명현적세포병변;간접면역형광검측이급분자표기험증결과표명병독증구성공,이차증구적병독여친본강독생장곡선몰유현저차이.이용증구적제5대극륭병독주대본동물진행치병성시험,결과현시실험저재감염후제3d개시출현체온승고、염식、소수등림상표현,발병솔체100％,재감염후20 d내륙속사망,표명증구적병독보지료여친본병독주상일치적치병특정,이상연구증실아문성공적구건병획득PRRSV강독HuN4주감염성극륭,위종기인수평상연구PRRSV적치병궤제제공료기술평태.