CAJ | 학술논문

目的:构建pET-32a(+)-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a(+)载体的Trx编码区融合产生pET-32a(+)-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a(+)-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2+金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a(+)-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.
목적:구건pET-32a(+)-PA중조질립,실현융합단백Trx-PA재대장간균(Escherichia coli) BL21(DE3)중적표체,병획득유생물학활성적PA.방법:채용PCR적방법확증PA적편마서렬,병차여pET-32a(+)재체적Trx편마구융합산생pET-32a(+)-PA중조질립,장중조질립전화지감수태E.coli BL21(DE3),경IPTG유도표체pET-32a(+)-PA,통과SDS-PAGE화Western인적진행분석.이용Ni2+금속친화층석순화표체산물,통과제도투석진행복성.통과단백매강해화세포독성실험분석Trx-PA적생물학활성.결과:성공구건pET-32a(+)-PA중조질립,병순화료Trx-PA융합단백.SDS-PAGE분석표명융합단백상대분자질량대소정학,경순화복성후,단백순도체도76%.Trx-PA재체내화체외균능피불림단백매(furin매)강해.Trx-PA적정학강해시치사인자(lethal factor,LF)진입소서거서세포Raw264.7내병산생세포독성적기출.결론:중조Trx-PA융합단백능재E.coli BL21(DE3)중유효표체,병표현출생물학활성.