中国病理生理杂志
中國病理生理雜誌
중국병리생리잡지
CHINESE JOURNAL OF PATHOPHYSIOLOGY
2009年
10期
2078-2080
,共3页
李雅林%白波%陈京%刘有旺%刘海青%路海
李雅林%白波%陳京%劉有旺%劉海青%路海
리아림%백파%진경%류유왕%류해청%로해
受体%阿片样%κ%重组真核表达载体%HEK293细胞
受體%阿片樣%κ%重組真覈錶達載體%HEK293細胞
수체%아편양%κ%중조진핵표체재체%HEK293세포
目的: 构建与海肾荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)融合的人κ型阿片受体(kappa opioid receptor, KOR)的真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用.方法: 以质粒pcDNA3.1-hKOR为模板,PCR方法扩增人KOR.扩增的人KOR用NotⅠ和XhoⅠ双酶切,同时用这2种酶双酶切质粒pRluc-pcDNA3.1.然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10.挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney 293,HEK293) 细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察.结果: 扩增出了1条约1.2 kb的片段,与预期的人KOR大小相符,质粒酶切结果显示重组质粒 pRluc-hKOR-pcDNA3.1被切成2条片段,其中1条为pRluc-pcDNA3.1载体大小,另1条为目的片段大小.经测序鉴定,序列与GenBank (NM_000912)中的序列高度同源.共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上.结论: 构建成功了pRluc-hKOR-pcDNA3.1重组真核表达载体,此表达载体可用于检测人KOR与其它受体之间的相互作用.
目的: 構建與海腎熒光素酶(renilla luciferase,Rluc)融閤的人κ型阿片受體(kappa opioid receptor, KOR)的真覈錶達載體,用于生物髮光共振能量轉移法檢測人KOR與其它受體間的相互作用.方法: 以質粒pcDNA3.1-hKOR為模闆,PCR方法擴增人KOR.擴增的人KOR用NotⅠ和XhoⅠ雙酶切,同時用這2種酶雙酶切質粒pRluc-pcDNA3.1.然後將這2種酶切產物按常規方法連接、轉化大腸桿菌Top10.挑取菌落培養,提取質粒,然後進行酶切鑒定,最後進行測序.將測序正確的重組載體用脂質體法轉染人胚胎腎(human embryonic kidney 293,HEK293) 細胞,免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡觀察.結果: 擴增齣瞭1條約1.2 kb的片段,與預期的人KOR大小相符,質粒酶切結果顯示重組質粒 pRluc-hKOR-pcDNA3.1被切成2條片段,其中1條為pRluc-pcDNA3.1載體大小,另1條為目的片段大小.經測序鑒定,序列與GenBank (NM_000912)中的序列高度同源.共聚焦顯微鏡觀察顯示,阿片受體主要錶達在細胞膜上.結論: 構建成功瞭pRluc-hKOR-pcDNA3.1重組真覈錶達載體,此錶達載體可用于檢測人KOR與其它受體之間的相互作用.
목적: 구건여해신형광소매(renilla luciferase,Rluc)융합적인κ형아편수체(kappa opioid receptor, KOR)적진핵표체재체,용우생물발광공진능량전이법검측인KOR여기타수체간적상호작용.방법: 이질립pcDNA3.1-hKOR위모판,PCR방법확증인KOR.확증적인KOR용NotⅠ화XhoⅠ쌍매절,동시용저2충매쌍매절질립pRluc-pcDNA3.1.연후장저2충매절산물안상규방법련접、전화대장간균Top10.도취균락배양,제취질립,연후진행매절감정,최후진행측서.장측서정학적중조재체용지질체법전염인배태신(human embryonic kidney 293,HEK293) 세포,면역형광염색,공취초현미경관찰.결과: 확증출료1조약1.2 kb적편단,여예기적인KOR대소상부,질립매절결과현시중조질립 pRluc-hKOR-pcDNA3.1피절성2조편단,기중1조위pRluc-pcDNA3.1재체대소,령1조위목적편단대소.경측서감정,서렬여GenBank (NM_000912)중적서렬고도동원.공취초현미경관찰현시,아편수체주요표체재세포막상.결론: 구건성공료pRluc-hKOR-pcDNA3.1중조진핵표체재체,차표체재체가용우검측인KOR여기타수체지간적상호작용.
