CAJ | 학술논문

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系.方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况.结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内.结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响.
목적: 구건pNTAP-PRAK진핵표체질립,병건립기은정표체적HEK293세포계.방법: 장인적PRAK아극륭지천련친화순화(tandem affinity purification, TAP)재체pNTAP질립상,구건성중조질립pNTAP-PRAK,전화해중조질립지감수태대장간균DH5α,양성극륭진행PCR、매절급DNA측서험증정학후,이용PolyFect지질체개도장기전염지HEK293세포중,재통과G418사선건립은정표체TAP tag-PRAK융합단백적HEK293세포계;이용Western blotting화세포면역형광표기법검측융합단백TAP tag-PRAK적표체급세포내정위정황.결과: 중조진핵표체재체구건정학,해중조질립능재HEK293세포중은정표체,표체산물TAP tag-PRAK주요분포재핵내.결론: 성공구건pNTAP-PRAK진핵표체재체병건립료기은정표체적HEK293세포계,TAP표첨미대PRAK정위산생명현영향.