水生生物学报
水生生物學報
수생생물학보
ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA
2010年
5期
1031-1036
,共6页
杨琳%汪亚平%廖兰杰%朱作言
楊琳%汪亞平%廖蘭傑%硃作言
양림%왕아평%료란걸%주작언
RNA干扰%小干扰RNA%小发夹RNA%Stem-loop RT-PCR%草鱼出血病病毒
RNA榦擾%小榦擾RNA%小髮夾RNA%Stem-loop RT-PCR%草魚齣血病病毒
RNA간우%소간우RNA%소발협RNA%Stem-loop RT-PCR%초어출혈병병독
由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面.多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种,操纵一段短发夹结构RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在细胞或体内表达.这一类启动子主要包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等.为了探明鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子是否能有效驱动shRNA在鱼体内表达,从而更好地利用RNAi进行鱼类基因功能和抗病毒研究,研究利用斑马鱼的H1和u6启动子以及草鱼的H1启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,分别构建了三个shRNA表达载体:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP.通过显微注射将三种表达载体分别导入稀有(鱼句)鲫(Gobiocypris rarus)受精卵中.由于siRNA片段很短,其表达检测非常困难,研究采用stem-loop RT-PCR方法,对稀有(鱼句)鲫胚胎发育不同时期的shRNA表达进行了检测.研究结果表明,采用的三种鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子均能有效驱动GCRVsiRNA的表达;在取样的各个胚胎发育时期均能检测到GCRV siRNA的表达;stem-loop RT-PCR方法可以便捷检测siRNA的表达.研究构建的鱼类胚胎siRNA有效持续表达载体,建立的简易快捷siRNA检测方法,为进一步的抗GCRV转基因鱼研制以及siRNA的病毒复制干扰机制研究奠定了重要基础并提供有力的技术支撑.
由小的榦擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)介導的RNA榦擾(RNA interference,RNAi)是近年來快速髮展的一種轉錄後基因沉默方法,已被廣汎的應用于基因功能的研究,基因網絡調控的探討以及疾病的治療等方麵.多數的siRNA錶達載體依賴RNA聚閤酶Ⅲ啟動子中的一種,操縱一段短髮夾結構RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在細胞或體內錶達.這一類啟動子主要包括人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子等.為瞭探明魚類自身的RNA聚閤酶Ⅲ啟動子是否能有效驅動shRNA在魚體內錶達,從而更好地利用RNAi進行魚類基因功能和抗病毒研究,研究利用斑馬魚的H1和u6啟動子以及草魚的H1啟動子,以草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣殼蛋白VP7基因為靶基因,以增彊型綠色熒光蛋白(eGFP)為報告基因,分彆構建瞭三箇shRNA錶達載體:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP.通過顯微註射將三種錶達載體分彆導入稀有(魚句)鯽(Gobiocypris rarus)受精卵中.由于siRNA片段很短,其錶達檢測非常睏難,研究採用stem-loop RT-PCR方法,對稀有(魚句)鯽胚胎髮育不同時期的shRNA錶達進行瞭檢測.研究結果錶明,採用的三種魚類自身的RNA聚閤酶Ⅲ啟動子均能有效驅動GCRVsiRNA的錶達;在取樣的各箇胚胎髮育時期均能檢測到GCRV siRNA的錶達;stem-loop RT-PCR方法可以便捷檢測siRNA的錶達.研究構建的魚類胚胎siRNA有效持續錶達載體,建立的簡易快捷siRNA檢測方法,為進一步的抗GCRV轉基因魚研製以及siRNA的病毒複製榦擾機製研究奠定瞭重要基礎併提供有力的技術支撐.
유소적간우RNA(Small interfering RNA,siRNA)개도적RNA간우(RNA interference,RNAi)시근년래쾌속발전적일충전록후기인침묵방법,이피엄범적응용우기인공능적연구,기인망락조공적탐토이급질병적치료등방면.다수적siRNA표체재체의뢰RNA취합매Ⅲ계동자중적일충,조종일단단발협결구RNA(Small hairpin RNA,shRNA)재세포혹체내표체.저일류계동자주요포괄인원화서원적U6계동자화인H1계동자등.위료탐명어류자신적RNA취합매Ⅲ계동자시부능유효구동shRNA재어체내표체,종이경호지이용RNAi진행어류기인공능화항병독연구,연구이용반마어적H1화u6계동자이급초어적H1계동자,이초어호장고병독(Grass carp reovirus,GCRV)외의각단백VP7기인위파기인,이증강형록색형광단백(eGFP)위보고기인,분별구건료삼개shRNA표체재체:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP화pCH1siGCRV-CMVeGFP.통과현미주사장삼충표체재체분별도입희유(어구)즉(Gobiocypris rarus)수정란중.유우siRNA편단흔단,기표체검측비상곤난,연구채용stem-loop RT-PCR방법,대희유(어구)즉배태발육불동시기적shRNA표체진행료검측.연구결과표명,채용적삼충어류자신적RNA취합매Ⅲ계동자균능유효구동GCRVsiRNA적표체;재취양적각개배태발육시기균능검측도GCRV siRNA적표체;stem-loop RT-PCR방법가이편첩검측siRNA적표체.연구구건적어류배태siRNA유효지속표체재체,건립적간역쾌첩siRNA검측방법,위진일보적항GCRV전기인어연제이급siRNA적병독복제간우궤제연구전정료중요기출병제공유력적기술지탱.
