CAJ | 학술논문

目的:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性.欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题,观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态.方法:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成.①对象:包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定.清洁级孕12.5～14.5 d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0 h后,按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上.上述两种成纤维细胞分别计数后,按1∶0,3∶1,1∶1, 1∶3,0∶1比例混合,然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层.③实验评估:观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态.并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测.撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况.结果:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层.②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1∶1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1∶3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例.③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300 bp和300~400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带.④体外分化实验:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞.结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,二者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态.②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好. 目的:人胚胎榦細胞傳代培養的關鍵是抑製其自髮分化、保證細胞的全能性.欲解決以小鼠胚胎成纖維細胞或人包皮成纖維細胞為常規飼養層培養人胚胎榦細胞時存在的問題,觀察兩者按一定比例製成的混閤飼養層上人胚胎榦細胞的生長狀態.方法:實驗于2006-04/2007-07在海南醫學院附屬醫院生殖醫學中心完成.①對象:包皮來自于行包皮環切的兒童,由海南醫學院附屬醫院泌尿外科提供,兒童傢屬對治療及實驗均籤署知情同意書,實驗經醫院醫學倫理委員會批準.人胚胎榦細胞繫HN-1由本實驗室從人類囊胚中分離培養併鑒定.清潔級孕12.5～14.5 d的胎鼠11隻,實驗過程中對動物的處置符閤動物倫理學標準.②實驗方法:將去除頭、四肢和內髒的胎鼠按常規胰蛋白酶反複消化法穫得細胞懸液進行接種培養,待生長彙閤後凍存部分原代細胞,用絲裂黴素C處理2.0～3.0 h後,按1×108 L-1密度接種于明膠包被的中心皿內,即小鼠胚胎成纖維細胞飼養層.人包皮成纖維細胞的分離培養與飼養層製備同上.上述兩種成纖維細胞分彆計數後,按1∶0,3∶1,1∶1, 1∶3,0∶1比例混閤,然後以1×108 L-1密度接種于明膠包被的中心皿內,即混閤飼養層.③實驗評估:觀察體外傳代培養的人胚胎榦細胞在3種不同飼養層上的生長狀態.併對生長在混閤飼養層上的人胚胎榦細胞進行堿性燐痠酶檢測、OCT-4錶達免疫組化檢測、OCT-4及耑粒酶mRNA錶達RT-PCR檢測.撤除飼養層,觀察人胚胎榦細胞體外分化情況.結果:①不同飼養層上人胚胎榦細胞的生長狀態比較:生長在小鼠胚胎成纖維細胞和人包皮成纖維細胞上的人胚胎榦細胞剋隆扁平、不飽滿,而生長在混閤飼養層上的人胚胎榦細胞剋隆飽滿、厚實,其剋隆形態顯著好于其他兩種飼養層.②人胚胎榦細胞在不同比例混閤飼養層上的生長狀態比較:小鼠胚胎成纖維細胞:人包皮成纖維細胞按1∶1混閤時,人胚胎榦細胞顯著堆積生長,剋隆邊緣清晰、隆起明顯且飽滿,按1∶3混閤時無明顯變化,優于其餘3種混閤比例.③混閤飼養層上人胚胎榦細胞未分化狀態的檢測:堿性燐痠酶染色及OCT-4抗原錶達均呈彊暘性,分彆在200～300 bp和300~400 bp處可見OCT-4和耑粒酶mRNA錶達的特異性條帶.④體外分化實驗:能形成擬胚體,貼壁後人胚胎榦細胞可分化為多種形態的細胞.結論:①與小鼠胚胎成纖維細胞或人包皮成纖維細胞常規飼養層相比,二者混閤飼養層能夠更好的支持人胚胎榦細胞的體外傳代培養,穫得更佳的剋隆形態.②小鼠胚胎成纖維細胞與人包皮成纖維細胞的混閤比例為1∶1時效果較好.
목적:인배태간세포전대배양적관건시억제기자발분화、보증세포적전능성.욕해결이소서배태성섬유세포혹인포피성섬유세포위상규사양층배양인배태간세포시존재적문제,관찰량자안일정비례제성적혼합사양층상인배태간세포적생장상태.방법:실험우2006-04/2007-07재해남의학원부속의원생식의학중심완성.①대상:포피래자우행포피배절적인동,유해남의학원부속의원비뇨외과제공,인동가속대치료급실험균첨서지정동의서,실험경의원의학윤리위원회비준.인배태간세포계HN-1유본실험실종인류낭배중분리배양병감정.청길급잉12.5～14.5 d적태서11지,실험과정중대동물적처치부합동물윤리학표준.②실험방법:장거제두、사지화내장적태서안상규이단백매반복소화법획득세포현액진행접충배양,대생장회합후동존부분원대세포,용사렬매소C처리2.0～3.0 h후,안1×108 L-1밀도접충우명효포피적중심명내,즉소서배태성섬유세포사양층.인포피성섬유세포적분리배양여사양층제비동상.상술량충성섬유세포분별계수후,안1∶0,3∶1,1∶1, 1∶3,0∶1비례혼합,연후이1×108 L-1밀도접충우명효포피적중심명내,즉혼합사양층.③실험평고:관찰체외전대배양적인배태간세포재3충불동사양층상적생장상태.병대생장재혼합사양층상적인배태간세포진행감성린산매검측、OCT-4표체면역조화검측、OCT-4급단립매mRNA표체RT-PCR검측.철제사양층,관찰인배태간세포체외분화정황.결과:①불동사양층상인배태간세포적생장상태비교:생장재소서배태성섬유세포화인포피성섬유세포상적인배태간세포극륭편평、불포만,이생장재혼합사양층상적인배태간세포극륭포만、후실,기극륭형태현저호우기타량충사양층.②인배태간세포재불동비례혼합사양층상적생장상태비교:소서배태성섬유세포:인포피성섬유세포안1∶1혼합시,인배태간세포현저퇴적생장,극륭변연청석、륭기명현차포만,안1∶3혼합시무명현변화,우우기여3충혼합비례.③혼합사양층상인배태간세포미분화상태적검측:감성린산매염색급OCT-4항원표체균정강양성,분별재200～300 bp화300~400 bp처가견OCT-4화단립매mRNA표체적특이성조대.④체외분화실험:능형성의배체,첩벽후인배태간세포가분화위다충형태적세포.결론:①여소서배태성섬유세포혹인포피성섬유세포상규사양층상비,이자혼합사양층능구경호적지지인배태간세포적체외전대배양,획득경가적극륭형태.②소서배태성섬유세포여인포피성섬유세포적혼합비례위1∶1시효과교호.