CAJ | 학술논문

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点.从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段.构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母.重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达.用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD.以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL.成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础.
납두격매납시종일본전통식품납두중발현적일류구유용전효과적단백매,유우기구유안전,고효,작용시간장,역흡수,렴개등우점,현재정성위일개개발치료혈전류질병약물적연구열점.종본실험실보존적일주고용전적납두간균N07출발,제취총기인조DNA,이용PCR수단확증획득료납두격매장위825bp적성숙태기인편단.구건중조표체질립pPICZaA-NK,경EcoR I、Xba I쌍매절、PCR、측서험증득출중조표체질립상적외원기인즉위825bp적목적편단;장중조질립pPICZaA-NK용내절매Sac I선성화후전격도입필적효모X33,통과함Zeocin적YPDS평판사선획득중조효모.중조효모재BMMY배양기중발효배양,용1%갑순유도목적단백표체.용섬유단백평판법검측발현발효상청구유섬용활성,경류산안염석、투석、Sephadex-G50과주등보취분리득도납두격매단백,진행SDS-PAGE감정표명,표체적납두격매단백분자량위27KD.이뇨격매위표준,실험소득납두격매발효상청액용전활성약위195U/mL.성공적장납두격매성숙태기인재필적효모X33중표체,위납두격매기인공정진일보연구전정기출.