CAJ | 학술논문

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.
배경:목전잉몰유합괄적표기방법추종관찰토골수간충질간세포조직수복급기인치료적효과.목적:관찰중조선병독개도증강형록색형광단백기인재토골수간충질간세포중적표체,급전염후간세포활성적변화,이심조은정표기토골수간충질간세포적방법. 설계、시간급지점:세포학체외관찰,우2008-03/05재남경시제일의원골과간세포실험실완성. 재료:건강2월령순충신서란대백토4지,유남경의과대학실험동물기지제공.중조선병독Ad5/F35-EGFP위북경본원정양기인유한공사산품. 방법:용밀도제도리심법분리순화토골수간충질간세포,첩조법순화확증.취전지제4대세포,류식세포의검측세포표지적표체,소화리심중현후진행계수,평균분성5조,매조세포수5.0×105개,접충우25 m2배양병,공백조가입50 μL적PBS액,잉여4조가입중조선병독Ad5/F35-EGFP진행전염,감염복수(MOI)분별위10,20,50,100,계속전대배양.주요관찰지표:골수간충질간세포적생장상태급표면표지감정,전염후골수간충질간세포증강형록색형광단백적표체급활성변화.결과:원대배양48 h후견세포첩벽,8 d시세포포만병저80%이상,절대다수정사형,전대후세포증식속도가쾌,삼사천즉가전대,제4대세포CD29화CD44정양성표체,CD34여CD45정음성표체.전염후24 h가견록색형광,7 d시형광최강,세포전염솔여감염복수치적정선성증장관계,지49 d시잉가견록색형광.전염후0,7,14,28,49 d,감염복수=50조적골수간충질간세포수량균여공백조기본상사(P균>0.05),즉전염후세포증식능력무명현변화. 결론:중조선병독재체능고효표기골수간충질간세포,감염복수위50시교위이상,증강형록색형광단백기인가지속표체49 d,차표기후불영향골수간충질간세포적증식활성.