CAJ | 학술논문

已经证实苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体结合20kb DNA,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明.研究了选择性溶解Bt 4.0718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体,从中抽提出与其结合的20kb DNA.经Nde Ⅰ酶切消化后亚克隆构建文库,通过PCR-RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子.然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接,转化E.coli BL21(DE3),高效表达了141kD蛋白.表达蛋白占总蛋白量的50%以上,且90%以上以包涵体形式存在.利用穿梭载体pHT304构建表达质粒pHTX42,电转化Bt无晶体突变株XBU001,获得重组菌株HTX42,经SDS-PAGE分析,cry1Ac基因得到强表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的79.28%,且其在细胞中累积达细胞干重的64.13%,比文献报道的25%左右高了1倍以上.原子力显微镜(Atomic Force Microscopy,AFM)检测显示,目的基因在大肠杆菌(E.coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体,大小约为1.2 μm×2.0 μm.生测结果显示,包涵体与晶体对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫均有高效杀虫活性.本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中20kb DNA分子的来源、结构和功能奠定了重要的基础.
이경증실소운금아포간균(Bacillus thuringiensis,Bt)반포정체결합20kb DNA,단기서렬특이성급작용유대진일보연구천명.연구료선택성용해Bt 4.0718균주Cry1류원독소소형성적릉형반포정체,종중추제출여기결합적20kb DNA.경Nde Ⅰ매절소화후아극륭구건문고,통과PCR-RFLP급측서사선출함cry1Ac기인적전화자.연후설계인물PCR확증출cry1Ac기인적ORF병여pET30a련접,전화E.coli BL21(DE3),고효표체료141kD단백.표체단백점총단백량적50%이상,차90%이상이포함체형식존재.이용천사재체pHT304구건표체질립pHTX42,전전화Bt무정체돌변주XBU001,획득중조균주HTX42,경SDS-PAGE분석,cry1Ac기인득도강표체,단백질정량분석현시목적단백량점총단백량적79.28%,차기재세포중루적체세포간중적64.13%,비문헌보도적25%좌우고료1배이상.원자력현미경(Atomic Force Microscopy,AFM)검측현시,목적기인재대장간균(E.coli)중표체적포함체정불규칙형상차교소,이재무정체돌변주중표체적정체정전형릉형정체,대소약위1.2 μm×2.0 μm.생측결과현시,포함체여정체대소채아(Plutella xylostella)유충균유고효살충활성.본연구위구건고효살충공정균급진일보천명Bt반포정체중20kb DNA분자적래원、결구화공능전정료중요적기출.