中国医药生物技术
中國醫藥生物技術
중국의약생물기술
CHINESE MEDICINAL BIOTECHNOLOGY
2008年
2期
93-97
,共5页
王静%于金龙%张婷%郭长江%徐琪寿%黄英武
王靜%于金龍%張婷%郭長江%徐琪壽%黃英武
왕정%우금룡%장정%곽장강%서기수%황영무
色氨酸%生物合成途径%大肠杆菌%基因表达调控,细菌
色氨痠%生物閤成途徑%大腸桿菌%基因錶達調控,細菌
색안산%생물합성도경%대장간균%기인표체조공,세균
目的 改造大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,以进一步提高色氨酸产量.方法 根据ppsA和tktA基因序列分别合成引物行PCR扩增,将PCR扩增所得PLacO1-tktA-T1片段和pZA31质粒连接,经筛选鉴定正确的pZA31-tktA重组质粒和PCR扩增所得PLacO1-ppsA-T1片段连接,构建pZA31-ppsA-tktA重组质粒,并进行测序鉴定.将鉴定正确的pZA31-ppsA-tktA和pZE12-arofbr-trpEDfor重组质粒共转化至E.coli MGl655ART-R,获得的重组菌株命名为E.coli MG1655△RT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfbr](工程茵);以pZEl2-aroGfbr-trpEDfbr重组质粒转化至E.coli MGl655ART-R得到的重组菌株E.coli MG1655△RT-R[pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]作为对照菌株,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,3 h后收集部分菌体行ppsA、tktA酶活性测定,其余发酵液继续培养4-5h后,监测调整培养基中葡萄糖浓度和pH值保持不变,48 h后检测色氨酸产量.结果 PCR扩增所得片段均与预期DNA表达片段大小一致;pZA31-ppsA-tktA重组质粒测序显示,克隆的tktA和ppsA基因序列与报告序列完全相同.工程菌ppsA和tktA酶活性(U)与对照菌株比较,分别提高了3和3.5倍(分别为0.25±0.04 vs.0.08±0.02,P<0.05:0.21±0.03 vs.0.06±0.02,P<0.05);色氨酸产量(g/L)与对照菌株比较,提高了13倍(1.10±0.05 vs.0.80±0.05,P<0.05).结论 成功改造了大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,进一步提高了色氨酸产量,为构建高产色氨酸基因工程菌打下了基础.
目的 改造大腸桿菌色氨痠生物閤成的中心代謝途徑,以進一步提高色氨痠產量.方法 根據ppsA和tktA基因序列分彆閤成引物行PCR擴增,將PCR擴增所得PLacO1-tktA-T1片段和pZA31質粒連接,經篩選鑒定正確的pZA31-tktA重組質粒和PCR擴增所得PLacO1-ppsA-T1片段連接,構建pZA31-ppsA-tktA重組質粒,併進行測序鑒定.將鑒定正確的pZA31-ppsA-tktA和pZE12-arofbr-trpEDfor重組質粒共轉化至E.coli MGl655ART-R,穫得的重組菌株命名為E.coli MG1655△RT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfbr](工程茵);以pZEl2-aroGfbr-trpEDfbr重組質粒轉化至E.coli MGl655ART-R得到的重組菌株E.coli MG1655△RT-R[pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]作為對照菌株,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導錶達,3 h後收集部分菌體行ppsA、tktA酶活性測定,其餘髮酵液繼續培養4-5h後,鑑測調整培養基中葡萄糖濃度和pH值保持不變,48 h後檢測色氨痠產量.結果 PCR擴增所得片段均與預期DNA錶達片段大小一緻;pZA31-ppsA-tktA重組質粒測序顯示,剋隆的tktA和ppsA基因序列與報告序列完全相同.工程菌ppsA和tktA酶活性(U)與對照菌株比較,分彆提高瞭3和3.5倍(分彆為0.25±0.04 vs.0.08±0.02,P<0.05:0.21±0.03 vs.0.06±0.02,P<0.05);色氨痠產量(g/L)與對照菌株比較,提高瞭13倍(1.10±0.05 vs.0.80±0.05,P<0.05).結論 成功改造瞭大腸桿菌色氨痠生物閤成的中心代謝途徑,進一步提高瞭色氨痠產量,為構建高產色氨痠基因工程菌打下瞭基礎.
목적 개조대장간균색안산생물합성적중심대사도경,이진일보제고색안산산량.방법 근거ppsA화tktA기인서렬분별합성인물행PCR확증,장PCR확증소득PLacO1-tktA-T1편단화pZA31질립련접,경사선감정정학적pZA31-tktA중조질립화PCR확증소득PLacO1-ppsA-T1편단련접,구건pZA31-ppsA-tktA중조질립,병진행측서감정.장감정정학적pZA31-ppsA-tktA화pZE12-arofbr-trpEDfor중조질립공전화지E.coli MGl655ART-R,획득적중조균주명명위E.coli MG1655△RT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfbr](공정인);이pZEl2-aroGfbr-trpEDfbr중조질립전화지E.coli MGl655ART-R득도적중조균주E.coli MG1655△RT-R[pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]작위대조균주,가입이병기-β-D-류대반유당감(IPTG)유도표체,3 h후수집부분균체행ppsA、tktA매활성측정,기여발효액계속배양4-5h후,감측조정배양기중포도당농도화pH치보지불변,48 h후검측색안산산량.결과 PCR확증소득편단균여예기DNA표체편단대소일치;pZA31-ppsA-tktA중조질립측서현시,극륭적tktA화ppsA기인서렬여보고서렬완전상동.공정균ppsA화tktA매활성(U)여대조균주비교,분별제고료3화3.5배(분별위0.25±0.04 vs.0.08±0.02,P<0.05:0.21±0.03 vs.0.06±0.02,P<0.05);색안산산량(g/L)여대조균주비교,제고료13배(1.10±0.05 vs.0.80±0.05,P<0.05).결론 성공개조료대장간균색안산생물합성적중심대사도경,진일보제고료색안산산량,위구건고산색안산기인공정균타하료기출.
