昆明医学院学报
昆明醫學院學報
곤명의학원학보
ACADEMIC JOURNAL OF KUNMING MEDICAL COLLEGE
2011年
4期
20-25
,共6页
王燕%李志伟%楚青%江萍%危群%陆晓青
王燕%李誌偉%楚青%江萍%危群%陸曉青
왕연%리지위%초청%강평%위군%륙효청
缺氧诱导因子-1a%RNA干扰%流式细胞术
缺氧誘導因子-1a%RNA榦擾%流式細胞術
결양유도인자-1a%RNA간우%류식세포술
目的 利用流式细胞术(FCM)协助筛选、纯化RNA干扰(RNAi)效率高的人缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)基因沉默肝癌细胞株.方法 选择带Neor及GFP基因的质粒pGenesil-1.1构建HIF-1α靶向小干扰RNA(siRNA)重组表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721.首先用G418筛选,然后用FCM检测出常氧、缺氧条件下HIF-1α蛋白表达抑制效率最高的转基因细胞株.根据FCM可分选GFP阳性细胞这一特点,进一步用流式细胞分选仪分选纯化转基因细胞,最后用PCR和免疫组化方法鉴定纯化细胞株的HIF-1α干扰效率.结果 单用G418筛选HIF-1α干扰组细胞最高筛选效率为32.9%,FCM检测HIF-1α蛋白抑制率为78.7%～92.8%;合并使用G418和FCM分选纯化后,最佳HIF-1α干扰组筛选效率达94.4%,常氧、缺氧条件下对HIF-1αmRNA表达抑制率分别为95.5%、85.2%.结论 合并使用G418及FCM分选纯化得到了高RNAi效率的人HIF-1α基因沉默肝癌细胞株,为进一步研究HIF-1α与肝癌关系及靶向HIF-1α的肝癌基因治疗提供了实验基础.
目的 利用流式細胞術(FCM)協助篩選、純化RNA榦擾(RNAi)效率高的人缺氧誘導因子1-α(HIF-1α)基因沉默肝癌細胞株.方法 選擇帶Neor及GFP基因的質粒pGenesil-1.1構建HIF-1α靶嚮小榦擾RNA(siRNA)重組錶達載體,轉染人肝癌細胞株SMMC7721.首先用G418篩選,然後用FCM檢測齣常氧、缺氧條件下HIF-1α蛋白錶達抑製效率最高的轉基因細胞株.根據FCM可分選GFP暘性細胞這一特點,進一步用流式細胞分選儀分選純化轉基因細胞,最後用PCR和免疫組化方法鑒定純化細胞株的HIF-1α榦擾效率.結果 單用G418篩選HIF-1α榦擾組細胞最高篩選效率為32.9%,FCM檢測HIF-1α蛋白抑製率為78.7%～92.8%;閤併使用G418和FCM分選純化後,最佳HIF-1α榦擾組篩選效率達94.4%,常氧、缺氧條件下對HIF-1αmRNA錶達抑製率分彆為95.5%、85.2%.結論 閤併使用G418及FCM分選純化得到瞭高RNAi效率的人HIF-1α基因沉默肝癌細胞株,為進一步研究HIF-1α與肝癌關繫及靶嚮HIF-1α的肝癌基因治療提供瞭實驗基礎.
목적 이용류식세포술(FCM)협조사선、순화RNA간우(RNAi)효솔고적인결양유도인자1-α(HIF-1α)기인침묵간암세포주.방법 선택대Neor급GFP기인적질립pGenesil-1.1구건HIF-1α파향소간우RNA(siRNA)중조표체재체,전염인간암세포주SMMC7721.수선용G418사선,연후용FCM검측출상양、결양조건하HIF-1α단백표체억제효솔최고적전기인세포주.근거FCM가분선GFP양성세포저일특점,진일보용류식세포분선의분선순화전기인세포,최후용PCR화면역조화방법감정순화세포주적HIF-1α간우효솔.결과 단용G418사선HIF-1α간우조세포최고사선효솔위32.9%,FCM검측HIF-1α단백억제솔위78.7%～92.8%;합병사용G418화FCM분선순화후,최가HIF-1α간우조사선효솔체94.4%,상양、결양조건하대HIF-1αmRNA표체억제솔분별위95.5%、85.2%.결론 합병사용G418급FCM분선순화득도료고RNAi효솔적인HIF-1α기인침묵간암세포주,위진일보연구HIF-1α여간암관계급파향HIF-1α적간암기인치료제공료실험기출.
