CAJ | 학술논문

背景与目的:Tet-off系统是一个高效、低毒、具有严密开关功能的基因调控系统,本研究构建质粒pTre-IFNγ,初步探讨Tet-off系统调控人干扰素γ(interferon-gamma,IFNγ)基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达.方法:SacⅡ、Xba Ⅰ双酶切载体pTre及目的基因,T4连接酶连接,重组体经双酶切、测序鉴定:脂质体介导pTet-off及pTre-IFNγ共转染小鼠骨髓基质细胞;RT-PCR法检测IFNγmRNA,ELISA法检测分泌到培养液中的IFNγ蛋白,分析共转染后IFNγ的分泌规律、共转染后48 h中不同浓度盐酸四环素对IFNγ蛋白分泌的影响及在共转染后第48 h加入盐酸四环素在不同时间阶段对IFNγ蛋白分泌的影响.结果:双酶切及测序证实质粒pTre-IFNγ构建成功;共转染后48 h RT-PCR检测到IFNγ mRNA表达;ELISA法示IFNγ蛋白分泌持续6天,第3天的分泌高峰为每1×106个细胞(720.09±241.51)Pg;共转染后48 h中蛋白分泌量随四环素浓度增加逐渐减少,10～100 ng/ml四环素存在时蛋白分泌接近零;第48 h时添加盐酸四环素后8 h即能明显抑制IFNγ蛋白表达,延长作用时间,抑制效应加重.结论:Tet-off系统能迅速而高效地下调人IFNγ基因在小鼠骨髓基质细胞中的表达.
배경여목적:Tet-off계통시일개고효、저독、구유엄밀개관공능적기인조공계통,본연구구건질립pTre-IFNγ,초보탐토Tet-off계통조공인간우소γ(interferon-gamma,IFNγ)기인재소서골수기질세포중적표체.방법:SacⅡ、Xba Ⅰ쌍매절재체pTre급목적기인,T4련접매련접,중조체경쌍매절、측서감정:지질체개도pTet-off급pTre-IFNγ공전염소서골수기질세포;RT-PCR법검측IFNγmRNA,ELISA법검측분비도배양액중적IFNγ단백,분석공전염후IFNγ적분비규률、공전염후48 h중불동농도염산사배소대IFNγ단백분비적영향급재공전염후제48 h가입염산사배소재불동시간계단대IFNγ단백분비적영향.결과:쌍매절급측서증실질립pTre-IFNγ구건성공;공전염후48 h RT-PCR검측도IFNγ mRNA표체;ELISA법시IFNγ단백분비지속6천,제3천적분비고봉위매1×106개세포(720.09±241.51)Pg;공전염후48 h중단백분비량수사배소농도증가축점감소,10～100 ng/ml사배소존재시단백분비접근령;제48 h시첨가염산사배소후8 h즉능명현억제IFNγ단백표체,연장작용시간,억제효응가중.결론:Tet-off계통능신속이고효지하조인IFNγ기인재소서골수기질세포중적표체.