CAJ | 학술논문

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序.实验结果表明: 突变后的荧光素酶在50 ℃环境中仍具有活性;在43 ℃下10 min活性保留大于80%,热稳定性明显增强.Western blot分析结果表明, 荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化.用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降.采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶.
신일대대규모초측서기술수요은정적가고정화적형광소매,위료제비열은정성호차피생물소화적형광소매,본연구채용기인공정방법장생물소최기재체단백C단87개안기산잔기(BCCP87)여형광소매재대장간균E. coli BL21(DE3)중진행융합표체,이실현균체내직접표체생물소화적형광소매(BCCP-LUC);병대북미형화충(Photinus pyralis)형광소매기인진행료정점돌변이증강기열은정성;용련친화소포피적자주대중조융합단백진행고정화,용우초측서.실험결과표명: 돌변후적형광소매재50 ℃배경중잉구유활성;재43 ℃하10 min활성보류대우80%,열은정성명현증강.Western blot분석결과표명, 형광소매능구재대장간균내생물소화.용련친화소포피적자주결합BCCP-LUC후구유교고활성(2.1×105RLU/μL Beads),경과다차세조활성무명현하강.채용미구고정적형광소매이급ATP류산화매성공적진행료DNA서렬적측정차정량준학,표명고정화적형광소매가이응용우초측서중,위건립고통량대규모심편초측서기술제공유효、은정적공구매.