中华检验医学杂志
中華檢驗醫學雜誌
중화검험의학잡지
CHINESE JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE
2010年
4期
337-342
,共6页
胡王强%孔凡慧%张晓霞%周武%陈兵华%胡理怀%陶志华
鬍王彊%孔凡慧%張曉霞%週武%陳兵華%鬍理懷%陶誌華
호왕강%공범혜%장효하%주무%진병화%호리부%도지화
抗原%肿瘤%启动区(遗传学)%多态现象%遗传%色谱法%高压液相%前列腺肿瘤
抗原%腫瘤%啟動區(遺傳學)%多態現象%遺傳%色譜法%高壓液相%前列腺腫瘤
항원%종류%계동구(유전학)%다태현상%유전%색보법%고압액상%전렬선종류
Antigens,neoplasm%Promoter regions(genetics)%Polymorphism,genetic%Chromatography,high pressure liquid%Prostatic neoplasms
目的 建立DHPLC技术分析PCa特异性PCA3基因启动子多态性的技术平台.方法 在PCA3基因启动子区域设计1对引物,以本室先前已经建立的11种(C_2T_6、C_2T_5、C_3T_5、C_2T_5/C_2T_6、 C_3T_3/C_3T_4、C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、 C_3T_5/C_1T_8、C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)已知多态性的PCA3基因启动子的克隆质粒为标准品,通过优化DHPLC检测体系,建立其多态性克隆质粒的标准图谱.采用完全随机设计,从200例病理确诊为PCa患者中选取147例,对其PCA3基因启动子的扩增产物进行DHPLC分析,比较各标本洗脱峰与标准克隆质粒的DHPLC图谱,以判断临床标本PCA3基因多态性类型,并对这些基因型再行克隆测序予以验证.结果 通过克隆质粒优化DHPLC检测体系,最适检测体系为:含44.3%A洗脱液(0.1 mol/L TEAA、0.025%ACN)和55.7%B洗脱液(0.1 mol/L TEAA、25%ACN)的起始洗脱梯度,含35.3%A洗脱液和64.7%B洗脱液的终止洗脱梯度,柱温53℃,流速:0.9 ml/min,在该条件下DHPLC用8种杂合型克隆质粒(C_2T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_3T_4、 C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_1T_8、 C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)进行重复性验证,结果 显示,同一多态性色谱峰中2峰的出峰时间之差的批问CV值在0%～6.67%之间.11种克隆质粒多态性标本仪通过1～2次洗脱,就能根据峰型和各峰的出峰时间将其区分开.147例PCa患者中,144例DHPLC检测结果 和克隆测序结果 一致(Kappa=1,P=0.000),并出现3种新的峰型,经克隆测序验证为3种新的多态性(C_3T_5/C_1T_6、C_2T_5/C_1T_8、C_3T_5/C_2T_7).结论 成功建立的DHPLC分析PCA3基因启动子多态性的技术方法 ,可对PCA3基因启动子多态性进行基因型别鉴定.该方法 具快速、准确、经济、高通量、重复性好、自动化等特点,为进一步研究PCa基因多态性提供了技术平台.
目的 建立DHPLC技術分析PCa特異性PCA3基因啟動子多態性的技術平檯.方法 在PCA3基因啟動子區域設計1對引物,以本室先前已經建立的11種(C_2T_6、C_2T_5、C_3T_5、C_2T_5/C_2T_6、 C_3T_3/C_3T_4、C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、 C_3T_5/C_1T_8、C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)已知多態性的PCA3基因啟動子的剋隆質粒為標準品,通過優化DHPLC檢測體繫,建立其多態性剋隆質粒的標準圖譜.採用完全隨機設計,從200例病理確診為PCa患者中選取147例,對其PCA3基因啟動子的擴增產物進行DHPLC分析,比較各標本洗脫峰與標準剋隆質粒的DHPLC圖譜,以判斷臨床標本PCA3基因多態性類型,併對這些基因型再行剋隆測序予以驗證.結果 通過剋隆質粒優化DHPLC檢測體繫,最適檢測體繫為:含44.3%A洗脫液(0.1 mol/L TEAA、0.025%ACN)和55.7%B洗脫液(0.1 mol/L TEAA、25%ACN)的起始洗脫梯度,含35.3%A洗脫液和64.7%B洗脫液的終止洗脫梯度,柱溫53℃,流速:0.9 ml/min,在該條件下DHPLC用8種雜閤型剋隆質粒(C_2T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_3T_4、 C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_1T_8、 C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)進行重複性驗證,結果 顯示,同一多態性色譜峰中2峰的齣峰時間之差的批問CV值在0%～6.67%之間.11種剋隆質粒多態性標本儀通過1～2次洗脫,就能根據峰型和各峰的齣峰時間將其區分開.147例PCa患者中,144例DHPLC檢測結果 和剋隆測序結果 一緻(Kappa=1,P=0.000),併齣現3種新的峰型,經剋隆測序驗證為3種新的多態性(C_3T_5/C_1T_6、C_2T_5/C_1T_8、C_3T_5/C_2T_7).結論 成功建立的DHPLC分析PCA3基因啟動子多態性的技術方法 ,可對PCA3基因啟動子多態性進行基因型彆鑒定.該方法 具快速、準確、經濟、高通量、重複性好、自動化等特點,為進一步研究PCa基因多態性提供瞭技術平檯.
목적 건립DHPLC기술분석PCa특이성PCA3기인계동자다태성적기술평태.방법 재PCA3기인계동자구역설계1대인물,이본실선전이경건립적11충(C_2T_6、C_2T_5、C_3T_5、C_2T_5/C_2T_6、 C_3T_3/C_3T_4、C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、 C_3T_5/C_1T_8、C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)이지다태성적PCA3기인계동자적극륭질립위표준품,통과우화DHPLC검측체계,건립기다태성극륭질립적표준도보.채용완전수궤설계,종200례병리학진위PCa환자중선취147례,대기PCA3기인계동자적확증산물진행DHPLC분석,비교각표본세탈봉여표준극륭질립적DHPLC도보,이판단림상표본PCA3기인다태성류형,병대저사기인형재행극륭측서여이험증.결과 통과극륭질립우화DHPLC검측체계,최괄검측체계위:함44.3%A세탈액(0.1 mol/L TEAA、0.025%ACN)화55.7%B세탈액(0.1 mol/L TEAA、25%ACN)적기시세탈제도,함35.3%A세탈액화64.7%B세탈액적종지세탈제도,주온53℃,류속:0.9 ml/min,재해조건하DHPLC용8충잡합형극륭질립(C_2T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_3T_4、 C_3T_5/C_4T_5、C_3T_5/C_2T_5、C_3T_5/C_2T_6、C_3T_5/C_1T_8、 C_2T_5/C_3T_4、C_2T_6/C_2T_7)진행중복성험증,결과 현시,동일다태성색보봉중2봉적출봉시간지차적비문CV치재0%～6.67%지간.11충극륭질립다태성표본의통과1～2차세탈,취능근거봉형화각봉적출봉시간장기구분개.147례PCa환자중,144례DHPLC검측결과 화극륭측서결과 일치(Kappa=1,P=0.000),병출현3충신적봉형,경극륭측서험증위3충신적다태성(C_3T_5/C_1T_6、C_2T_5/C_1T_8、C_3T_5/C_2T_7).결론 성공건립적DHPLC분석PCA3기인계동자다태성적기술방법 ,가대PCA3기인계동자다태성진행기인형별감정.해방법 구쾌속、준학、경제、고통량、중복성호、자동화등특점,위진일보연구PCa기인다태성제공료기술평태.
Objective To establish a detection method based on DHPLC for determining the polymorphisms of PCA3 gene promoter.Methods Primers were designed for amplification of the promoter of PCA3 gene.The cloning plasmids containing C_2T_6,C_2T_5,C_3T_5,C_2T_5/C_2T_6, C_3T_5/C_3T_4,C_3T_5/C_4T_5,C_3T_5/C_2T_5,C_3T_5/C_2T_6, C_3T_5/C_1T_8 C_2T_5/C_3T_4 and C_2T_6/C_2T_7 detected in our previous study,were used as reference.The polymorphism profiles of promoters from cloning plasmids were established by optimized DHPLC.One hundred and forty-seven out of 200 blood samples from the patients with PCa verified by histopathological examination were selected for DHPLC analysis.The polymorphisms of PCA3 promoter determined by DHPLC were acquired by comparing the elution peak of the clinical samples with the cloning plasmids.The polymorphisms detected by DHPLC was verified by DNA clone-sequencing.Results The optimal parameters of DHPLC for determining the polymorphisms of PCA3 promoter were as follows: start gradient,44.3%A eluent(0.1 mol/L TEAA,0.025% ACN)and 55.7% B eluent(0.1 mol/L TEAA,25%ACN); stop gradient,35.3% A eluent and 64.7% B eluent; column temperature 53℃; flow rate0.9 ml/min.There was a high reproducibility of the method of DHPLC.The inter assay coefficients variation of 8 heterozygotic cloning plasmids(C_2T_5/C_2T_6,C_3T_5/C_3T_4,C_3T_5/C_4T_5, C_3T_5/C_2T_5, C_3T_5/C_2T_6,C_3T_5/C_1T_8,C_2T_5/C_3T_4 and C_2T_6/C_2T_7)were 0%-6.67%.The pelymorphisms of promoters of 11 cloning plasmids could be distinguished by their elution peak shape and the elution time of each peak through eluting1～2 times.The results of 144 out of 147 PCa samples determined by DHPLC were in accordance with those obtained by DNA clone-sequencing(Kappa=1,P=0.00).Three new polymorphisms(C_3T_5/C_1T_6,C_2T_5/C_1T_8 and C_3T_5/C_2T_7)were found and confirmed by clone-sequencing.Conclusions It is successful to establish the analysis system of DHPLC for PCA3 gene promoter polymorphism detection which is accurate,rapid,high-throughput,high reproducible,automatic and cost-effective.This method could be applied to the further study of PCa gene polymorphism.
