临床神经外科杂志
臨床神經外科雜誌
림상신경외과잡지
JOURNAL OF CLINICAL NEUROSURGERY
2012年
1期
11-14
,共4页
吴俊%赖国政%叶飞%雷霆
吳俊%賴國政%葉飛%雷霆
오준%뢰국정%협비%뢰정
Chk1%Chk2%RNA干扰%短发夹RNA
Chk1%Chk2%RNA榦擾%短髮夾RNA
Chk1%Chk2%RNA간우%단발협RNA
目的 构建针对细胞周期检测点激酶1和2(Chk1和Chk2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,包装成慢病毒,建立稳定转染的细胞株,为探讨抑制Chk1和Chk2基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础.方法 根据GenBank数据库提供的Chk1和Chk2基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,命名为Chk1 - shRNA和Chk2-shRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为blank-shRNA.并与pLKO.1-TRC质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑取阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶EcoR Ⅰ、Nco Ⅰ酶切电泳,DNA测序鉴定,包装慢病毒.3组重组表达慢病毒载体转染胶质瘤细胞系U251,用嘌呤霉素筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株.逆转录酶-聚合酶连反应(RT-PCR)和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测Chk1和Chk2的表达.结果 重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确.嘌呤霉素对U251细胞的筛选浓度为4ug/ml,筛选出稳定转染三种质粒的U251细胞,Chk1-shRNA和Chk2-shRNA组细胞各自Chk1和Chk2的mRNA和蛋白表达水平明显低于blank-shRNA组.结论 成功构建了针对Chk1和Chk2基因的shRNA慢病毒表达载体,转染后可抑制Chk1和Chk2基因的表达,为进一步研究Chk1和Chk2基因在脑胶质瘤细胞中的作用奠定了基础.
目的 構建針對細胞週期檢測點激酶1和2(Chk1和Chk2)基因的短髮夾RNA(shRNA)錶達載體,包裝成慢病毒,建立穩定轉染的細胞株,為探討抑製Chk1和Chk2基因錶達對腦膠質瘤細胞生物學行為調控的研究奠定基礎.方法 根據GenBank數據庫提供的Chk1和Chk2基因覈苷痠序列,選擇設計2條能轉錄短髮夾RNA(shRNA)的DNA序列,命名為Chk1 - shRNA和Chk2-shRNA,同時設計1條非特異性序列作為陰性對照,命名為blank-shRNA.併與pLKO.1-TRC質粒載體連接,轉化感受態大腸桿菌,挑取暘性剋隆,抽取重組質粒,使用限製性內切酶EcoR Ⅰ、Nco Ⅰ酶切電泳,DNA測序鑒定,包裝慢病毒.3組重組錶達慢病毒載體轉染膠質瘤細胞繫U251,用嘌呤黴素篩選後挑選單剋隆併擴增穫得穩定株.逆轉錄酶-聚閤酶連反應(RT-PCR)和Western blot分彆在mRNA和蛋白水平上檢測Chk1和Chk2的錶達.結果 重組質粒成功轉化感受態大腸桿菌,經酶切瓊脂糖凝膠電泳分析,結果錶明寡覈苷痠成功插入到預計位點,經測序鑒定,序列完全正確.嘌呤黴素對U251細胞的篩選濃度為4ug/ml,篩選齣穩定轉染三種質粒的U251細胞,Chk1-shRNA和Chk2-shRNA組細胞各自Chk1和Chk2的mRNA和蛋白錶達水平明顯低于blank-shRNA組.結論 成功構建瞭針對Chk1和Chk2基因的shRNA慢病毒錶達載體,轉染後可抑製Chk1和Chk2基因的錶達,為進一步研究Chk1和Chk2基因在腦膠質瘤細胞中的作用奠定瞭基礎.
목적 구건침대세포주기검측점격매1화2(Chk1화Chk2)기인적단발협RNA(shRNA)표체재체,포장성만병독,건립은정전염적세포주,위탐토억제Chk1화Chk2기인표체대뇌효질류세포생물학행위조공적연구전정기출.방법 근거GenBank수거고제공적Chk1화Chk2기인핵감산서렬,선택설계2조능전록단발협RNA(shRNA)적DNA서렬,명명위Chk1 - shRNA화Chk2-shRNA,동시설계1조비특이성서렬작위음성대조,명명위blank-shRNA.병여pLKO.1-TRC질립재체련접,전화감수태대장간균,도취양성극륭,추취중조질립,사용한제성내절매EcoR Ⅰ、Nco Ⅰ매절전영,DNA측서감정,포장만병독.3조중조표체만병독재체전염효질류세포계U251,용표령매소사선후도선단극륭병확증획득은정주.역전록매-취합매련반응(RT-PCR)화Western blot분별재mRNA화단백수평상검측Chk1화Chk2적표체.결과 중조질립성공전화감수태대장간균,경매절경지당응효전영분석,결과표명과핵감산성공삽입도예계위점,경측서감정,서렬완전정학.표령매소대U251세포적사선농도위4ug/ml,사선출은정전염삼충질립적U251세포,Chk1-shRNA화Chk2-shRNA조세포각자Chk1화Chk2적mRNA화단백표체수평명현저우blank-shRNA조.결론 성공구건료침대Chk1화Chk2기인적shRNA만병독표체재체,전염후가억제Chk1화Chk2기인적표체,위진일보연구Chk1화Chk2기인재뇌효질류세포중적작용전정료기출.
