重庆医学
重慶醫學
중경의학
CHONGQING MEDICAL JOURNAL
2010年
15期
1945-1947
,共3页
邹志鹏%许万福%冯丽%柯志勇%邓凡
鄒誌鵬%許萬福%馮麗%柯誌勇%鄧凡
추지붕%허만복%풍려%가지용%산범
蛋白激酶D1%AP1%siRNA%转录激活
蛋白激酶D1%AP1%siRNA%轉錄激活
단백격매D1%AP1%siRNA%전록격활
目的 研究蛋白激酶D1(PKD1)对人HeLa细胞中AP1转录激活作用,为探讨PKD1作用的AP1靶基因的功能作用奠定基础.方法 首先将对照质粒pcDNA3.1、PKD1野生型质粒(pcDNA-PKD1)或无激酶活性突变型质粒pcDNA-PKD1-DN与AP1转录活性报告质粒pAP1-luc及内参照报告质粒pRL-SV40共转染人HeLa细胞,同时将对照siRNA(si-CTL)或PKD1 siRNA(siRNA-PKD1)与AP1转录活性报告质粒pAP1-luc及内参照报告质粒pRL-SV40也共转染人HeLa细胞.转染48 h后,分别收集细胞裂解液进行Western blot 检测外源性PKD1过表达或内源性PKD1敲低状况,并以Promega双报告基因分析试剂盒测定AP1荧光素酶活性,计算AP1相对转录活性.结果 Western blot证实HeLa细胞中外源性pcDNA-PKD1、pcDNA-PKD1-DN过表达,而且siRNA-PKD1明显敲低HeLa细胞中内源性PKD1表达;双色荧光素酶报告基因检测表明,与对照质粒pcDNA3.1比较,pcDNA-PKD1过表达明显增强AP1转录活性(P<0.05),相反,与pcDNA-PKD1比较,pcDNA-PKD1-DN过表达则明显降低AP1转录活性(P<0.05).与之相符,与si-CTL比较,siRNA-PKD1对内源性PKD1敲低,也明显抑制AP1转录活性(P<0.01).结论 PKD1表达和激酶活性增强HeLa细胞中AP1转录激活,提示PKD1 可能通过AP1调控相关靶基因表达.
目的 研究蛋白激酶D1(PKD1)對人HeLa細胞中AP1轉錄激活作用,為探討PKD1作用的AP1靶基因的功能作用奠定基礎.方法 首先將對照質粒pcDNA3.1、PKD1野生型質粒(pcDNA-PKD1)或無激酶活性突變型質粒pcDNA-PKD1-DN與AP1轉錄活性報告質粒pAP1-luc及內參照報告質粒pRL-SV40共轉染人HeLa細胞,同時將對照siRNA(si-CTL)或PKD1 siRNA(siRNA-PKD1)與AP1轉錄活性報告質粒pAP1-luc及內參照報告質粒pRL-SV40也共轉染人HeLa細胞.轉染48 h後,分彆收集細胞裂解液進行Western blot 檢測外源性PKD1過錶達或內源性PKD1敲低狀況,併以Promega雙報告基因分析試劑盒測定AP1熒光素酶活性,計算AP1相對轉錄活性.結果 Western blot證實HeLa細胞中外源性pcDNA-PKD1、pcDNA-PKD1-DN過錶達,而且siRNA-PKD1明顯敲低HeLa細胞中內源性PKD1錶達;雙色熒光素酶報告基因檢測錶明,與對照質粒pcDNA3.1比較,pcDNA-PKD1過錶達明顯增彊AP1轉錄活性(P<0.05),相反,與pcDNA-PKD1比較,pcDNA-PKD1-DN過錶達則明顯降低AP1轉錄活性(P<0.05).與之相符,與si-CTL比較,siRNA-PKD1對內源性PKD1敲低,也明顯抑製AP1轉錄活性(P<0.01).結論 PKD1錶達和激酶活性增彊HeLa細胞中AP1轉錄激活,提示PKD1 可能通過AP1調控相關靶基因錶達.
목적 연구단백격매D1(PKD1)대인HeLa세포중AP1전록격활작용,위탐토PKD1작용적AP1파기인적공능작용전정기출.방법 수선장대조질립pcDNA3.1、PKD1야생형질립(pcDNA-PKD1)혹무격매활성돌변형질립pcDNA-PKD1-DN여AP1전록활성보고질립pAP1-luc급내삼조보고질립pRL-SV40공전염인HeLa세포,동시장대조siRNA(si-CTL)혹PKD1 siRNA(siRNA-PKD1)여AP1전록활성보고질립pAP1-luc급내삼조보고질립pRL-SV40야공전염인HeLa세포.전염48 h후,분별수집세포렬해액진행Western blot 검측외원성PKD1과표체혹내원성PKD1고저상황,병이Promega쌍보고기인분석시제합측정AP1형광소매활성,계산AP1상대전록활성.결과 Western blot증실HeLa세포중외원성pcDNA-PKD1、pcDNA-PKD1-DN과표체,이차siRNA-PKD1명현고저HeLa세포중내원성PKD1표체;쌍색형광소매보고기인검측표명,여대조질립pcDNA3.1비교,pcDNA-PKD1과표체명현증강AP1전록활성(P<0.05),상반,여pcDNA-PKD1비교,pcDNA-PKD1-DN과표체칙명현강저AP1전록활성(P<0.05).여지상부,여si-CTL비교,siRNA-PKD1대내원성PKD1고저,야명현억제AP1전록활성(P<0.01).결론 PKD1표체화격매활성증강HeLa세포중AP1전록격활,제시PKD1 가능통과AP1조공상관파기인표체.
