中国实验血液学杂志
中國實驗血液學雜誌
중국실험혈액학잡지
JOURNAL OF EXPERIMENTAL HEMATOLOGY
2011年
6期
1456-1461
,共6页
郑卫东%刘艳辉%罗盈%姚志彬
鄭衛東%劉豔輝%囉盈%姚誌彬
정위동%류염휘%라영%요지빈
凝血因子ⅩⅢ缺陷症%Arg77Cys错义突变%Arg174 stop无义突变%分子病理机制
凝血因子ⅩⅢ缺陷癥%Arg77Cys錯義突變%Arg174 stop無義突變%分子病理機製
응혈인자ⅩⅢ결함증%Arg77Cys착의돌변%Arg174 stop무의돌변%분자병리궤제
本研究以凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)基因突变为研究的切入点,从分子水平研究这些突变致病的机制.构建野生型FⅩⅢA重组表达质粒,用定点突变方法获得含有2种突变(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重组表达质粒.分别将上述重组质粒通过脂质体介导的基因转移方法转染到COS-7细胞表达;用发色底物法检测转染细胞中FⅩⅢ活性,荧光定量RT-PCR、Western blot及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测转染细胞中人FⅩⅢA的RNA表达水平和蛋白表达量.结果表明:含有2种突变( Arg77Cys及Arg174 stop)的FⅩⅢA重组质粒转染组FⅩⅢA mRNA 相对表达丰度分别为0.82 +0.21和0.76±0.17,与野生型FⅩⅢA重组质粒转染组(1.06±0.51)比较没有显著性差异(p＞0.05).野生型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物中FⅩⅢ活性为(61.6±30.4)％,浓缩的细胞培养上清液中FⅩⅢ活性为(24.0±2.9)％,而2种突变型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物及培养上清液FⅩⅢ活性明显减低.转染细胞裂解物的Westem blot分析显示,含Arg77Cys错义突变的FⅩⅢA重组蛋白在培养细胞内含量明显减低,仅见1条微弱的条带.ELISA证实,野生型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物中FⅩⅢA:Ag量为(32.8±14.5)％,浓缩的细胞培养上清液中FⅩⅢ:Ag量为(13.2±2.3)％.而2种突变型FⅩⅢA重组质粒转染细胞裂解物及培养上清液中FⅩⅢA:Ag水平极度减低,低于ELISA检测低限.结论:FⅩⅢA Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变未导致FⅩⅢA mRNA水平的显著减低,但都可以导致FⅩⅢA蛋白水平的表达异常.在本研究先天性FⅩⅢ缺陷症患者中FⅩⅢA重度缺乏可能是FⅩⅢA Arg77Cys错义突变和Arg174stop无义突变的共同作用所致.
本研究以凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)基因突變為研究的切入點,從分子水平研究這些突變緻病的機製.構建野生型FⅩⅢA重組錶達質粒,用定點突變方法穫得含有2種突變(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重組錶達質粒.分彆將上述重組質粒通過脂質體介導的基因轉移方法轉染到COS-7細胞錶達;用髮色底物法檢測轉染細胞中FⅩⅢ活性,熒光定量RT-PCR、Western blot及酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測轉染細胞中人FⅩⅢA的RNA錶達水平和蛋白錶達量.結果錶明:含有2種突變( Arg77Cys及Arg174 stop)的FⅩⅢA重組質粒轉染組FⅩⅢA mRNA 相對錶達豐度分彆為0.82 +0.21和0.76±0.17,與野生型FⅩⅢA重組質粒轉染組(1.06±0.51)比較沒有顯著性差異(p＞0.05).野生型FⅩⅢA重組質粒轉染細胞裂解物中FⅩⅢ活性為(61.6±30.4)％,濃縮的細胞培養上清液中FⅩⅢ活性為(24.0±2.9)％,而2種突變型FⅩⅢA重組質粒轉染細胞裂解物及培養上清液FⅩⅢ活性明顯減低.轉染細胞裂解物的Westem blot分析顯示,含Arg77Cys錯義突變的FⅩⅢA重組蛋白在培養細胞內含量明顯減低,僅見1條微弱的條帶.ELISA證實,野生型FⅩⅢA重組質粒轉染細胞裂解物中FⅩⅢA:Ag量為(32.8±14.5)％,濃縮的細胞培養上清液中FⅩⅢ:Ag量為(13.2±2.3)％.而2種突變型FⅩⅢA重組質粒轉染細胞裂解物及培養上清液中FⅩⅢA:Ag水平極度減低,低于ELISA檢測低限.結論:FⅩⅢA Arg77Cys錯義突變和Arg174stop無義突變未導緻FⅩⅢA mRNA水平的顯著減低,但都可以導緻FⅩⅢA蛋白水平的錶達異常.在本研究先天性FⅩⅢ缺陷癥患者中FⅩⅢA重度缺乏可能是FⅩⅢA Arg77Cys錯義突變和Arg174stop無義突變的共同作用所緻.
본연구이응혈인자ⅩⅢ(FⅩⅢ)기인돌변위연구적절입점,종분자수평연구저사돌변치병적궤제.구건야생형FⅩⅢA중조표체질립,용정점돌변방법획득함유2충돌변(Arg77Cys급Arg174stop)적FⅩⅢA중조표체질립.분별장상술중조질립통과지질체개도적기인전이방법전염도COS-7세포표체;용발색저물법검측전염세포중FⅩⅢ활성,형광정량RT-PCR、Western blot급매련면역흡부실험(ELISA)검측전염세포중인FⅩⅢA적RNA표체수평화단백표체량.결과표명:함유2충돌변( Arg77Cys급Arg174 stop)적FⅩⅢA중조질립전염조FⅩⅢA mRNA 상대표체봉도분별위0.82 +0.21화0.76±0.17,여야생형FⅩⅢA중조질립전염조(1.06±0.51)비교몰유현저성차이(p＞0.05).야생형FⅩⅢA중조질립전염세포렬해물중FⅩⅢ활성위(61.6±30.4)％,농축적세포배양상청액중FⅩⅢ활성위(24.0±2.9)％,이2충돌변형FⅩⅢA중조질립전염세포렬해물급배양상청액FⅩⅢ활성명현감저.전염세포렬해물적Westem blot분석현시,함Arg77Cys착의돌변적FⅩⅢA중조단백재배양세포내함량명현감저,부견1조미약적조대.ELISA증실,야생형FⅩⅢA중조질립전염세포렬해물중FⅩⅢA:Ag량위(32.8±14.5)％,농축적세포배양상청액중FⅩⅢ:Ag량위(13.2±2.3)％.이2충돌변형FⅩⅢA중조질립전염세포렬해물급배양상청액중FⅩⅢA:Ag수평겁도감저,저우ELISA검측저한.결론:FⅩⅢA Arg77Cys착의돌변화Arg174stop무의돌변미도치FⅩⅢA mRNA수평적현저감저,단도가이도치FⅩⅢA단백수평적표체이상.재본연구선천성FⅩⅢ결함증환자중FⅩⅢA중도결핍가능시FⅩⅢA Arg77Cys착의돌변화Arg174stop무의돌변적공동작용소치.
