四川大学学报（医学版）
四川大學學報（醫學版）
사천대학학보（의학판）
JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE EDITION)
2008年
4期
523-526
,共4页
贾志云%欧晓红%魏海燕%邓候富%黄蕤%王金蓉%张仕琼
賈誌雲%歐曉紅%魏海燕%鄧候富%黃蕤%王金蓉%張仕瓊
가지운%구효홍%위해연%산후부%황유%왕금용%장사경
腺病毒载体%人去甲肾上腺素转运蛋白%同源重组
腺病毒載體%人去甲腎上腺素轉運蛋白%同源重組
선병독재체%인거갑신상선소전운단백%동원중조
目的 以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体.方法 利用限制性内切酶Kpn I+Xba I从pCMV5质粒中切下目的 基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,Pine I酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的 基因的重组体质粒Ad-hNET,Pac I酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒.采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度.结果 测序结果证明hNET序列的正确,PCR、Pac I酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功.扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL.结论 成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作.
目的 以複製缺陷的腺病毒為載體,用細菌內同源重組法構建含有人的去甲腎上腺素轉運子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒載體.方法 利用限製性內切酶Kpn I+Xba I從pCMV5質粒中切下目的 基因hNET,亞剋隆至經同樣酶切的腺病毒穿梭質粒pAdtrack-CMV,形成重組穿梭質粒pAdtrack-CMV-hNET,Pine I酶切線性化後,與pAdeasy-1在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組,穫得含目的 基因的重組體質粒Ad-hNET,Pac I酶切後用脂質體Lipofectamine2000轉染HEK293細胞,包裝成重組體腺病毒.採用PCR技術和Western Blotting對重組體腺病毒進行鑒定,利用穿梭質粒pAdTrack-CMV中帶有綠色熒光蛋白報告基因檢測錶達,經過擴增和純化,測定病毒滴度.結果 測序結果證明hNET序列的正確,PCR、Pac I酶切電泳和Western Blotting證實腺病毒重組質粒Ad-hNET構建成功.擴增純化後測定重組病毒Ad-hNET的滴度為1.2×1010pfu/mL.結論 成功構建瞭能錶達hNET基因的重組腺病毒載體,為腫瘤的靶嚮治療提供前期的研究工作.
목적 이복제결함적선병독위재체,용세균내동원중조법구건함유인적거갑신상선소전운자(human neurotransmitter transporter,hNET)기인적선병독재체.방법 이용한제성내절매Kpn I+Xba I종pCMV5질립중절하목적 기인hNET,아극륭지경동양매절적선병독천사질립pAdtrack-CMV,형성중조천사질립pAdtrack-CMV-hNET,Pine I매절선성화후,여pAdeasy-1재대장간균BJ5183중진행동원중조,획득함목적 기인적중조체질립Ad-hNET,Pac I매절후용지질체Lipofectamine2000전염HEK293세포,포장성중조체선병독.채용PCR기술화Western Blotting대중조체선병독진행감정,이용천사질립pAdTrack-CMV중대유록색형광단백보고기인검측표체,경과확증화순화,측정병독적도.결과 측서결과증명hNET서렬적정학,PCR、Pac I매절전영화Western Blotting증실선병독중조질립Ad-hNET구건성공.확증순화후측정중조병독Ad-hNET적적도위1.2×1010pfu/mL.결론 성공구건료능표체hNET기인적중조선병독재체,위종류적파향치료제공전기적연구공작.
