畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2011年
10期
1374-1379
,共6页
上官陶%张勃伟%孙薇薇%黄欣%张涌
上官陶%張勃偉%孫薇薇%黃訢%張湧
상관도%장발위%손미미%황흔%장용
溶葡萄球菌素基因%乳腺特异表达%牛乳腺上皮细胞%牛胎儿成纤维细胞%转基因核供体细胞
溶葡萄毬菌素基因%乳腺特異錶達%牛乳腺上皮細胞%牛胎兒成纖維細胞%轉基因覈供體細胞
용포도구균소기인%유선특이표체%우유선상피세포%우태인성섬유세포%전기인핵공체세포
本研究旨在构建溶葡萄球菌素基因牛乳腺特异表达载体(pEPB),转染牛胎儿成纤维细胞,为制备溶葡萄球菌素基因的转基因克隆牛提供核供体细胞.本研究以pEGFP-C1为载体骨架,通过PCR扩增牛2.6 kb的β-酪蛋白5′调控区及0.6 kb的3′侧翼区(poly A)序列作为调控序列,制备成含有绿色荧光和新霉素筛选标记的牛乳腺特异表达载体,经PCR和酶切鉴定正确后,用转染试剂FuGene HD反复转染牛pEPB乳腺上皮细胞3～5次,用催乳素诱导后,经免疫荧光分析,检测目的蛋白的表达.然后,用电转染法转染牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选得到阳性细胞后,把阳性细胞扩大培养并提取其基因组,因为溶葡萄球菌素基因是外源基因,经PCR及Southern blot 检测来确定目的基因是否已经整合到细胞的基因组上.结果表明,溶葡萄球菌素基因在牛乳腺细胞中得到了表达,并整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中,得到了转溶葡萄球菌索基因的核供体细胞.结果显示,本研究所获得的转基因牛胎儿成纤维细胞可作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究.
本研究旨在構建溶葡萄毬菌素基因牛乳腺特異錶達載體(pEPB),轉染牛胎兒成纖維細胞,為製備溶葡萄毬菌素基因的轉基因剋隆牛提供覈供體細胞.本研究以pEGFP-C1為載體骨架,通過PCR擴增牛2.6 kb的β-酪蛋白5′調控區及0.6 kb的3′側翼區(poly A)序列作為調控序列,製備成含有綠色熒光和新黴素篩選標記的牛乳腺特異錶達載體,經PCR和酶切鑒定正確後,用轉染試劑FuGene HD反複轉染牛pEPB乳腺上皮細胞3～5次,用催乳素誘導後,經免疫熒光分析,檢測目的蛋白的錶達.然後,用電轉染法轉染牛胎兒成纖維細胞,經G418篩選得到暘性細胞後,把暘性細胞擴大培養併提取其基因組,因為溶葡萄毬菌素基因是外源基因,經PCR及Southern blot 檢測來確定目的基因是否已經整閤到細胞的基因組上.結果錶明,溶葡萄毬菌素基因在牛乳腺細胞中得到瞭錶達,併整閤到牛胎兒成纖維細胞的基因組中,得到瞭轉溶葡萄毬菌索基因的覈供體細胞.結果顯示,本研究所穫得的轉基因牛胎兒成纖維細胞可作為體細胞覈移植的供體細胞進行轉基因剋隆牛研究.
본연구지재구건용포도구균소기인우유선특이표체재체(pEPB),전염우태인성섬유세포,위제비용포도구균소기인적전기인극륭우제공핵공체세포.본연구이pEGFP-C1위재체골가,통과PCR확증우2.6 kb적β-락단백5′조공구급0.6 kb적3′측익구(poly A)서렬작위조공서렬,제비성함유록색형광화신매소사선표기적우유선특이표체재체,경PCR화매절감정정학후,용전염시제FuGene HD반복전염우pEPB유선상피세포3～5차,용최유소유도후,경면역형광분석,검측목적단백적표체.연후,용전전염법전염우태인성섬유세포,경G418사선득도양성세포후,파양성세포확대배양병제취기기인조,인위용포도구균소기인시외원기인,경PCR급Southern blot 검측래학정목적기인시부이경정합도세포적기인조상.결과표명,용포도구균소기인재우유선세포중득도료표체,병정합도우태인성섬유세포적기인조중,득도료전용포도구균색기인적핵공체세포.결과현시,본연구소획득적전기인우태인성섬유세포가작위체세포핵이식적공체세포진행전기인극륭우연구.
