畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2011年
4期
521-526
,共6页
谢金鹿%王洪梅%刘国艺%武建明%刘晓%高运东%于力%仲跻峰%何洪彬
謝金鹿%王洪梅%劉國藝%武建明%劉曉%高運東%于力%仲躋峰%何洪彬
사금록%왕홍매%류국예%무건명%류효%고운동%우력%중제봉%하홍빈
口蹄疫病毒%VP2%转染%稳定细胞系
口蹄疫病毒%VP2%轉染%穩定細胞繫
구제역병독%VP2%전염%은정세포계
本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系.利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofeetamineTM 2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞.再通过Western Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDV VP2基因的BHK-21细胞系.结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60 d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系.上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMDV诱导细胞凋亡中的作用奠定基础.
本試驗旨在構建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重組錶達載體,併建立穩定錶達VP2基因的BHK-21細胞繫.利用RT-PCR方法擴增Asia 1型FMDV的cDNA,穫得VP2基因完整的編碼區,構建可錶達VP2的帶有綠色熒光蛋白標記基因的pIRES2-EGFP-VP2重組錶達載體.經鑒定正確後,利用LipofeetamineTM 2000將重組質粒轉染293T細胞,通過Western Blot技術檢測VP2蛋白的瞬時錶達;然後再轉染BHK-21細胞,通過G418篩選,形成單剋隆細胞繫,經熒光篩選到錶達EGFP的抗性單剋隆細胞,擴繁培養剋隆細胞.再通過Western Blot技術檢測其VP2的錶達,最終篩選到穩定錶達FMDV VP2基因的BHK-21細胞繫.結果錶明,VP2基因重組錶達載體pIRES2-EGFP-VP2構建正確,能夠在293T細胞內瞬時錶達;轉染BHK-21細胞,經G418篩選到錶達VP2基因的BHK-21細胞剋隆,經長達60 d的傳代,穫得瞭穩定錶達VP2基因和EGFP的BHK-21細胞繫.上述結果錶明,我們建立瞭穩定錶達VP2基因的BHK-21細胞繫,為進一步探討VP2基因在FMDV誘導細胞凋亡中的作用奠定基礎.
본시험지재구건Asia 1형구제역병독(FMDV)적VP2기인중조표체재체,병건립은정표체VP2기인적BHK-21세포계.이용RT-PCR방법확증Asia 1형FMDV적cDNA,획득VP2기인완정적편마구,구건가표체VP2적대유록색형광단백표기기인적pIRES2-EGFP-VP2중조표체재체.경감정정학후,이용LipofeetamineTM 2000장중조질립전염293T세포,통과Western Blot기술검측VP2단백적순시표체;연후재전염BHK-21세포,통과G418사선,형성단극륭세포계,경형광사선도표체EGFP적항성단극륭세포,확번배양극륭세포.재통과Western Blot기술검측기VP2적표체,최종사선도은정표체FMDV VP2기인적BHK-21세포계.결과표명,VP2기인중조표체재체pIRES2-EGFP-VP2구건정학,능구재293T세포내순시표체;전염BHK-21세포,경G418사선도표체VP2기인적BHK-21세포극륭,경장체60 d적전대,획득료은정표체VP2기인화EGFP적BHK-21세포계.상술결과표명,아문건립료은정표체VP2기인적BHK-21세포계,위진일보탐토VP2기인재FMDV유도세포조망중적작용전정기출.
