CAJ | 학술논문

背景:目前血管内皮细胞生长因子制备困难,来源有限,限制了临床的应用.目的:用基因工程的方法在人肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子165,分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性.为后期构建携带血管内皮生长因子165蛋白的预成血管化组织工程骨提供了充足的蛋白来源.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2005-04/2007-01在陕两省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:携带目的基因血管内皮生长因子165的克降质粒PUC18-VEGF165由西安交通大学第二医院时志斌博士构建,PGEM-T easv 质粒购自美国Promerga公司,原核表达质粒购自德国Qiagen公司,DH5 α、M15、JM109菌株由陕西省疾病预防控制中心病毒研究室保存.方法:利用聚合酶链反应亚克隆的方法获得目的基因片段,构建表达质粒pQE30-VEGF165,在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2+-NTA进行蛋纯化.经过纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白.主要观察指标:①人血管内皮生长因子165基因的亚克隆结果.②重组表达载体pQE30-hVEGF165的鉴定结果.③人血管内皮生长因子165蛋白的诱导表达、纯化.④使用ELISA和Western blot技术检测人血管内皮生长因子165蛋白免疫学活性.⑤鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性.结果:重组表达质粒pQE30-VEGF165在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为23 000的蛋白,其以不溶性的包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%左右,经过分离和Ni柱纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白,浓度约为0.2g/L,ELISA和Western blot实验显示其具有良好的免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验显示表达蛋白具有良好的生物学活性.结论:实验在原核细胞中稳定、高效表达了具有活性的血管内皮生长因子165蛋白,为后期预构血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源. 揹景:目前血管內皮細胞生長因子製備睏難,來源有限,限製瞭臨床的應用.目的:用基因工程的方法在人腸桿菌中誘導錶達人血管內皮生長因子165,分離純化併檢測其免疫學以及生物學活性.為後期構建攜帶血管內皮生長因子165蛋白的預成血管化組織工程骨提供瞭充足的蛋白來源.設計、時間及地點:開放性實驗,單一樣本觀察,于2005-04/2007-01在陝兩省疾病預防控製中心病毒室完成.材料:攜帶目的基因血管內皮生長因子165的剋降質粒PUC18-VEGF165由西安交通大學第二醫院時誌斌博士構建,PGEM-T easv 質粒購自美國Promerga公司,原覈錶達質粒購自德國Qiagen公司,DH5 α、M15、JM109菌株由陝西省疾病預防控製中心病毒研究室保存.方法:利用聚閤酶鏈反應亞剋隆的方法穫得目的基因片段,構建錶達質粒pQE30-VEGF165,在大腸桿菌JM109中用IPTG進行誘導錶達併使用Ni2+-NTA進行蛋純化.經過純化穫得瞭血管內皮生長因子165蛋白.主要觀察指標:①人血管內皮生長因子165基因的亞剋隆結果.②重組錶達載體pQE30-hVEGF165的鑒定結果.③人血管內皮生長因子165蛋白的誘導錶達、純化.④使用ELISA和Western blot技術檢測人血管內皮生長因子165蛋白免疫學活性.⑤鷄胚尿囊絨毛膜試驗和matrigel血管形成實驗檢測其生物學活性.結果:重組錶達質粒pQE30-VEGF165在大腸桿菌中成功地錶達瞭相對分子質量為23 000的蛋白,其以不溶性的包涵體形式存在,佔菌體蛋白的30%左右,經過分離和Ni柱純化穫得瞭血管內皮生長因子165蛋白,濃度約為0.2g/L,ELISA和Western blot實驗顯示其具有良好的免疫學活性,鷄胚尿囊絨毛膜試驗和matrigel血管形成實驗顯示錶達蛋白具有良好的生物學活性.結論:實驗在原覈細胞中穩定、高效錶達瞭具有活性的血管內皮生長因子165蛋白,為後期預構血管化組織工程骨的構建提供瞭充足的蛋白來源.
배경:목전혈관내피세포생장인자제비곤난,래원유한,한제료림상적응용.목적:용기인공정적방법재인장간균중유도표체인혈관내피생장인자165,분리순화병검측기면역학이급생물학활성.위후기구건휴대혈관내피생장인자165단백적예성혈관화조직공정골제공료충족적단백래원.설계、시간급지점:개방성실험,단일양본관찰,우2005-04/2007-01재협량성질병예방공제중심병독실완성.재료:휴대목적기인혈관내피생장인자165적극강질립PUC18-VEGF165유서안교통대학제이의원시지빈박사구건,PGEM-T easv 질립구자미국Promerga공사,원핵표체질립구자덕국Qiagen공사,DH5 α、M15、JM109균주유합서성질병예방공제중심병독연구실보존.방법:이용취합매련반응아극륭적방법획득목적기인편단,구건표체질립pQE30-VEGF165,재대장간균JM109중용IPTG진행유도표체병사용Ni2+-NTA진행단순화.경과순화획득료혈관내피생장인자165단백.주요관찰지표:①인혈관내피생장인자165기인적아극륭결과.②중조표체재체pQE30-hVEGF165적감정결과.③인혈관내피생장인자165단백적유도표체、순화.④사용ELISA화Western blot기술검측인혈관내피생장인자165단백면역학활성.⑤계배뇨낭융모막시험화matrigel혈관형성실험검측기생물학활성.결과:중조표체질립pQE30-VEGF165재대장간균중성공지표체료상대분자질량위23 000적단백,기이불용성적포함체형식존재,점균체단백적30%좌우,경과분리화Ni주순화획득료혈관내피생장인자165단백,농도약위0.2g/L,ELISA화Western blot실험현시기구유량호적면역학활성,계배뇨낭융모막시험화matrigel혈관형성실험현시표체단백구유량호적생물학활성.결론:실험재원핵세포중은정、고효표체료구유활성적혈관내피생장인자165단백,위후기예구혈관화조직공정골적구건제공료충족적단백래원.