CAJ | 학술논문

目的:建立长期传代、形态和生物学特性稳定的永生化HSC.方法:采用Pronase E、Ⅳ型胶原酶原位灌流消化及Nycodenz密度梯度离心分离大鼠原代肝星状细胞(HSC),并进行免疫组化SABC法鉴定和培养.用Effectene(R) Ttansfection Reagent方法将携带SV40LTag基因的质粒PSV3neo(该质粒由意大利学者Giovanni Gaudino PhD惠赠)转染第1代HSC,以G418筛选直至获得阳性克隆细胞,经体外长期培养和传代后,以PCR方法检测其SV40LT抗原mRNA的表达,观察细胞形态学,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖能力,用免疫组化SABC法对α-SMA、SV40LTag、Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen Ⅰ、collagen Ⅲ)、desmin、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生的生长因子受体B型(PDGFRB)进行免疫细胞化学检测,用β-actin做半定量RT-PCR检测I型胶原的表达,对其生物学特性进行研究.结果:本研究通过使用质粒PSV3neo转染正常大鼠HSC,经20 d抗性筛选,获得G418阳性克隆细胞,长期传代后细胞形态和结构保持完好,SV40LTag mRNA的表达检测和免疫组化染色结果阳性,经扩大筛选培养,该HSC细胞系目前已传了50代,保持着星形外观的HSC形态学特征,生长曲线显示转染阳性细胞倍增速度快,MTT法测定570 nm波长下A值显著高于对照组(P＜0.01).半定量RT-PCR法检测collagen Ⅰ mRNA的表达明显高于对照组(P＜0.01).免疫组化染色显示能表达α-SMA、collagen Ⅰ、couagen Ⅲ、desmin、TGF-β1、PDGFRB.结论:利用SV40LTag基因序列诱导建立了永生化大鼠HSC系,新建HSC系在体外可长期传代,倍增速度快,其形态和生物学特性与原代HSC形态相似.
목적:건립장기전대、형태화생물학특성은정적영생화HSC.방법:채용Pronase E、Ⅳ형효원매원위관류소화급Nycodenz밀도제도리심분리대서원대간성상세포(HSC),병진행면역조화SABC법감정화배양.용Effectene(R) Ttansfection Reagent방법장휴대SV40LTag기인적질립PSV3neo(해질립유의대리학자Giovanni Gaudino PhD혜증)전염제1대HSC,이G418사선직지획득양성극륭세포,경체외장기배양화전대후,이PCR방법검측기SV40LT항원mRNA적표체,관찰세포형태학,회제세포생장곡선,MTT법검측세포증식능력,용면역조화SABC법대α-SMA、SV40LTag、Ⅰ、Ⅲ형효원(collagen Ⅰ、collagen Ⅲ)、desmin、전화생장인자-β1(TGF-β1)、혈소판연생적생장인자수체B형(PDGFRB)진행면역세포화학검측,용β-actin주반정량RT-PCR검측I형효원적표체,대기생물학특성진행연구.결과:본연구통과사용질립PSV3neo전염정상대서HSC,경20 d항성사선,획득G418양성극륭세포,장기전대후세포형태화결구보지완호,SV40LTag mRNA적표체검측화면역조화염색결과양성,경확대사선배양,해HSC세포계목전이전료50대,보지착성형외관적HSC형태학특정,생장곡선현시전염양성세포배증속도쾌,MTT법측정570 nm파장하A치현저고우대조조(P＜0.01).반정량RT-PCR법검측collagen Ⅰ mRNA적표체명현고우대조조(P＜0.01).면역조화염색현시능표체α-SMA、collagen Ⅰ、couagen Ⅲ、desmin、TGF-β1、PDGFRB.결론:이용SV40LTag기인서렬유도건립료영생화대서HSC계,신건HSC계재체외가장기전대,배증속도쾌,기형태화생물학특성여원대HSC형태상사.