CAJ | 학술논문

目的:Persephin是近年来发现的对多巴胺神经元的发育与分化起调控作用重要基因,单纯神经干细胞系C17.2移植治疗帕金森病在体内分化为多巴胺能神经元比例不高.实验构建了人Persephin基因重组腺病毒载体,并观察其在C17.2神经干细胞的表达.方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成(广东省重点实验室).①实验材料:流产胚胎由中山大学附属第二医院妇产科提供,产妇及其家属均签署知情同意书.病毒骨架质粒载体pAdEasy-1、穿梭载体PAdTrack-CMV(含绿色荧光蛋白基因)、大肠杆菌菌株BJ5183和DH5α、人胚肾293细胞均为本室保存.C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠.②实验方法:采用反转录聚合酶链式反应从人胚胎脑获得Persephin cDNA.将重组质粒pAdTrack-CMV-Persephin与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVPersephin,转化体外培养的C17.2神经干细胞.③实验评估:用原位杂交、免疫组化、Westernblot法检测Persephin在C17.2神经干细胞中的表达.结果:①人Persephin基因的克隆与测序分析:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,其Persephin基因片段长约310 bp,与预期分子量相符.Persephin基因被克隆于载体pMD18-T,以SaiⅠ和XhoⅠ双酶切可回收长约310 bp的克隆片段,测序结果证实所克隆的为人Persephin cDNA.②大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组及鉴定:Persephin重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-Persephin用PacⅠ酶切可切出4.1 kb的目标片断,PCR鉴定可从重组腺病毒质粒中可扩增出PersephincDNA片断(310 bp).病毒滴度在脂质体转染后为1.9×107 pfu/L.用收集的上清4次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度经绿色荧光蛋白检测达3.0×1011 pfu/L.③Persephjn基因在C17.2神经干细胞中的表达:免疫组化与原位杂交显示转染pAdPersephin的C17.2神经干细胞胞浆中有Persephin蛋白和mRNA表达.提取感染病毒的C17.2神经干细胞的总蛋白,经Western blot检测可见一特异性蛋白条带存在.结论:采用RT-PCR法成功克隆人Persephin cDNA并构建其腺病毒载体,获得了稳定表达Persephin的神经干细胞克隆,为进一步分析转基因神经干细胞治疗神经退行性疾病提供可行的操作方法. 目的:Persephin是近年來髮現的對多巴胺神經元的髮育與分化起調控作用重要基因,單純神經榦細胞繫C17.2移植治療帕金森病在體內分化為多巴胺能神經元比例不高.實驗構建瞭人Persephin基因重組腺病毒載體,併觀察其在C17.2神經榦細胞的錶達.方法:實驗于2005-06/12在中山大學附屬第二醫院林百訢實驗中心完成(廣東省重點實驗室).①實驗材料:流產胚胎由中山大學附屬第二醫院婦產科提供,產婦及其傢屬均籤署知情同意書.病毒骨架質粒載體pAdEasy-1、穿梭載體PAdTrack-CMV(含綠色熒光蛋白基因)、大腸桿菌菌株BJ5183和DH5α、人胚腎293細胞均為本室保存.C17.2神經榦細胞由美國哈彿大學醫學院Snyder教授惠贈.②實驗方法:採用反轉錄聚閤酶鏈式反應從人胚胎腦穫得Persephin cDNA.將重組質粒pAdTrack-CMV-Persephin與骨架質粒pAdEasy-1共轉染大腸桿菌BJ5183,穫得重組腺病毒質粒.將重組腺病毒質粒轉染293細胞包裝穫得重組腺病毒AdCMVPersephin,轉化體外培養的C17.2神經榦細胞.③實驗評估:用原位雜交、免疫組化、Westernblot法檢測Persephin在C17.2神經榦細胞中的錶達.結果:①人Persephin基因的剋隆與測序分析:瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物,其Persephin基因片段長約310 bp,與預期分子量相符.Persephin基因被剋隆于載體pMD18-T,以SaiⅠ和XhoⅠ雙酶切可迴收長約310 bp的剋隆片段,測序結果證實所剋隆的為人Persephin cDNA.②大腸桿菌同源重組穫得剋隆化重組腺病毒基因組及鑒定:Persephin重組腺病毒質粒pAdTrack-CMV-Persephin用PacⅠ酶切可切齣4.1 kb的目標片斷,PCR鑒定可從重組腺病毒質粒中可擴增齣PersephincDNA片斷(310 bp).病毒滴度在脂質體轉染後為1.9×107 pfu/L.用收集的上清4次重複感染293細胞擴增重組腺病毒後,病毒滴度經綠色熒光蛋白檢測達3.0×1011 pfu/L.③Persephjn基因在C17.2神經榦細胞中的錶達:免疫組化與原位雜交顯示轉染pAdPersephin的C17.2神經榦細胞胞漿中有Persephin蛋白和mRNA錶達.提取感染病毒的C17.2神經榦細胞的總蛋白,經Western blot檢測可見一特異性蛋白條帶存在.結論:採用RT-PCR法成功剋隆人Persephin cDNA併構建其腺病毒載體,穫得瞭穩定錶達Persephin的神經榦細胞剋隆,為進一步分析轉基因神經榦細胞治療神經退行性疾病提供可行的操作方法.
목적:Persephin시근년래발현적대다파알신경원적발육여분화기조공작용중요기인,단순신경간세포계C17.2이식치료파금삼병재체내분화위다파알능신경원비례불고.실험구건료인Persephin기인중조선병독재체,병관찰기재C17.2신경간세포적표체.방법:실험우2005-06/12재중산대학부속제이의원림백흔실험중심완성(광동성중점실험실).①실험재료:유산배태유중산대학부속제이의원부산과제공,산부급기가속균첨서지정동의서.병독골가질립재체pAdEasy-1、천사재체PAdTrack-CMV(함록색형광단백기인)、대장간균균주BJ5183화DH5α、인배신293세포균위본실보존.C17.2신경간세포유미국합불대학의학원Snyder교수혜증.②실험방법:채용반전록취합매련식반응종인배태뇌획득Persephin cDNA.장중조질립pAdTrack-CMV-Persephin여골가질립pAdEasy-1공전염대장간균BJ5183,획득중조선병독질립.장중조선병독질립전염293세포포장획득중조선병독AdCMVPersephin,전화체외배양적C17.2신경간세포.③실험평고:용원위잡교、면역조화、Westernblot법검측Persephin재C17.2신경간세포중적표체.결과:①인Persephin기인적극륭여측서분석:경지당응효전영검측PCR확증산물,기Persephin기인편단장약310 bp,여예기분자량상부.Persephin기인피극륭우재체pMD18-T,이SaiⅠ화XhoⅠ쌍매절가회수장약310 bp적극륭편단,측서결과증실소극륭적위인Persephin cDNA.②대장간균동원중조획득극륭화중조선병독기인조급감정:Persephin중조선병독질립pAdTrack-CMV-Persephin용PacⅠ매절가절출4.1 kb적목표편단,PCR감정가종중조선병독질립중가확증출PersephincDNA편단(310 bp).병독적도재지질체전염후위1.9×107 pfu/L.용수집적상청4차중복감염293세포확증중조선병독후,병독적도경록색형광단백검측체3.0×1011 pfu/L.③Persephjn기인재C17.2신경간세포중적표체:면역조화여원위잡교현시전염pAdPersephin적C17.2신경간세포포장중유Persephin단백화mRNA표체.제취감염병독적C17.2신경간세포적총단백,경Western blot검측가견일특이성단백조대존재.결론:채용RT-PCR법성공극륭인Persephin cDNA병구건기선병독재체,획득료은정표체Persephin적신경간세포극륭,위진일보분석전기인신경간세포치료신경퇴행성질병제공가행적조작방법.