中华麻醉学杂志
中華痳醉學雜誌
중화마취학잡지
CHINESE JOURNAL OF ANESTHESIOLOGY
2004年
12期
896-900
,共5页
尤圣武%俞卫锋%于布为%钱其军%王星华%苏长青%曹云飞%杨立群%李晓青
尤聖武%俞衛鋒%于佈為%錢其軍%王星華%囌長青%曹雲飛%楊立群%李曉青
우골무%유위봉%우포위%전기군%왕성화%소장청%조운비%양립군%리효청
β-内啡肽%神经生长因子%腺病毒科
β-內啡肽%神經生長因子%腺病毒科
β-내배태%신경생장인자%선병독과
目的构建并鉴定携带小鼠神经生长因子前导肽(PN)和人β-内啡肽(β-EP)融合基因非增殖型腺病毒(Ad-NEP).方法取出生2周、雄性昆明小鼠的颌下腺组织,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到PN上游部分序列,全基因合成PN下游部分和人β-EP序列并将其与PN上游部分连接成融合基因并测序.采用AdEasyTM System细菌内重组的方法构建携带小鼠PN和人β-EP融合基因非增殖型腺病毒,PCR鉴定后扩增不含野毒的阳性克隆并纯化,采用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度;体外转染人皮肤癌上皮(A431)细胞,3 d后RT-PCR观察融合基因的转录,免疫组化法检测细胞内β-EP的表达,放射免疫法检测感染后1、3、7 d时培养基内β-EP的浓度.结果融合基因序列正确,PCR可检测到475 bp的融合基因条带并排除野病毒株,腺病毒Ad-NEP滴度为1.5×1010pfu/ml.A431细胞转染病毒后3 d RT-PCR可以检测到475 bp大小的融合基因片段,免疫组化染色后细胞内出现橙黄色浓染颗粒,Ad-NEP组感染后1、3、7 d时细胞培养基内人β-EP浓度高于对照组(P＜0.01),感染后3、7 d Ad-NEP组β-EP浓度比感染后1 d高(P＜0.05或0.01).结论成功构建能在体外培养的非神经内分泌细胞内外高效转基因表达人β-EP的重组腺病毒.
目的構建併鑒定攜帶小鼠神經生長因子前導肽(PN)和人β-內啡肽(β-EP)融閤基因非增殖型腺病毒(Ad-NEP).方法取齣生2週、雄性昆明小鼠的頜下腺組織,逆轉錄聚閤酶鏈反應(RT-PCR)擴增得到PN上遊部分序列,全基因閤成PN下遊部分和人β-EP序列併將其與PN上遊部分連接成融閤基因併測序.採用AdEasyTM System細菌內重組的方法構建攜帶小鼠PN和人β-EP融閤基因非增殖型腺病毒,PCR鑒定後擴增不含野毒的暘性剋隆併純化,採用50%組織培養感染劑量(TCID50)法測定病毒滴度;體外轉染人皮膚癌上皮(A431)細胞,3 d後RT-PCR觀察融閤基因的轉錄,免疫組化法檢測細胞內β-EP的錶達,放射免疫法檢測感染後1、3、7 d時培養基內β-EP的濃度.結果融閤基因序列正確,PCR可檢測到475 bp的融閤基因條帶併排除野病毒株,腺病毒Ad-NEP滴度為1.5×1010pfu/ml.A431細胞轉染病毒後3 d RT-PCR可以檢測到475 bp大小的融閤基因片段,免疫組化染色後細胞內齣現橙黃色濃染顆粒,Ad-NEP組感染後1、3、7 d時細胞培養基內人β-EP濃度高于對照組(P＜0.01),感染後3、7 d Ad-NEP組β-EP濃度比感染後1 d高(P＜0.05或0.01).結論成功構建能在體外培養的非神經內分泌細胞內外高效轉基因錶達人β-EP的重組腺病毒.
목적구건병감정휴대소서신경생장인자전도태(PN)화인β-내배태(β-EP)융합기인비증식형선병독(Ad-NEP).방법취출생2주、웅성곤명소서적합하선조직,역전록취합매련반응(RT-PCR)확증득도PN상유부분서렬,전기인합성PN하유부분화인β-EP서렬병장기여PN상유부분련접성융합기인병측서.채용AdEasyTM System세균내중조적방법구건휴대소서PN화인β-EP융합기인비증식형선병독,PCR감정후확증불함야독적양성극륭병순화,채용50%조직배양감염제량(TCID50)법측정병독적도;체외전염인피부암상피(A431)세포,3 d후RT-PCR관찰융합기인적전록,면역조화법검측세포내β-EP적표체,방사면역법검측감염후1、3、7 d시배양기내β-EP적농도.결과융합기인서렬정학,PCR가검측도475 bp적융합기인조대병배제야병독주,선병독Ad-NEP적도위1.5×1010pfu/ml.A431세포전염병독후3 d RT-PCR가이검측도475 bp대소적융합기인편단,면역조화염색후세포내출현등황색농염과립,Ad-NEP조감염후1、3、7 d시세포배양기내인β-EP농도고우대조조(P＜0.01),감염후3、7 d Ad-NEP조β-EP농도비감염후1 d고(P＜0.05혹0.01).결론성공구건능재체외배양적비신경내분비세포내외고효전기인표체인β-EP적중조선병독.
